银杏黄酮对心肌缺血再灌注损伤大鼠的心肌保护作用及其作用机制研究

赵艳荣，张国斌，邴飞虹

430000湖北省武汉市，武汉道一堂中医医院(赵艳荣，邴飞虹)；河南中医学院药学院(张国斌)



·论著·

银杏黄酮对心肌缺血再灌注损伤大鼠的心肌保护作用及其作用机制研究

赵艳荣，张国斌，邴飞虹

430000湖北省武汉市，武汉道一堂中医医院(赵艳荣，邴飞虹)；河南中医学院药学院(张国斌)

【摘要】目的 探讨银杏黄酮对心肌缺血再灌注(MI/R)损伤大鼠的心肌保护作用及其作用机制。方法将80只大鼠随机分为假手术组、模型组、银杏黄酮低剂量组和银杏黄酮高剂量组，各20只。采用左冠状动脉前降支结扎30 min再灌注2 h的方法制备MI/R损伤模型，假手术组开胸但不结扎冠状动脉，腹腔注射等体积1%二甲基亚砜(DMSO)；模型组制备MI/R损伤模型，腹腔注射等体积1% DMSO；银杏黄酮低剂量组制备MI/R损伤模型，腹腔注射100 mg/kg银杏黄酮10 ml/kg；银杏黄酮高剂量组制备MI/R损伤模型，腹腔注射200 mg/kg银杏黄酮10 ml/kg。4组大鼠均于术前1周开始给药，1次/d。再灌注成功后处死各组大鼠，并比较4组大鼠心肌梗死面积、心肌组织髓过氧化物酶(MPO)活性及心肌组织核转录因子κB(NF-κB)和细胞间黏附分子-1(ICAM-1)表达情况。结果模型组大鼠心肌梗死面积占心室总面积的百分比高于银杏黄酮低剂量组和银杏黄酮高剂量组(P<0.05)；银杏黄酮低剂量组和银杏黄酮高剂量组大鼠心肌梗死面积占心室总面积的百分比比较，差异无统计学意义(P>0.05)。模型组、银杏黄酮低剂量组和银杏黄酮高剂量组大鼠心肌组织MPO活性高于假手术组，模型组大鼠心肌组织MPO活性高于银杏黄酮低剂量组和银杏黄酮高剂量组(P<0.05)；银杏黄酮低剂量组和银杏黄酮高剂量组大鼠心肌组织MPO活性比较，差异无统计学意义(P>0.05)。模型组、银杏黄酮低剂量组和银杏黄酮高剂量组大鼠心肌组织ICAM-1阳性区面积所占百分比和NF-κB阳性区面积所占百分比高于假手术组，模型组大鼠心肌组织ICAM-1阳性区面积所占百分比和NF-κB阳性区面积所占百分比高于银杏黄酮低剂量组和银杏黄酮高剂量组(P<0.05)；银杏黄酮低剂量组和银杏黄酮高剂量组大鼠心肌组织ICAM-1阳性区面积所占百分比和NF-κB阳性区面积所占百分比比较，差异无统计学意义(P>0.05)。结论银杏黄酮对MI/R损伤大鼠心肌具有保护作用，其作用机制可能与抑制中性粒细胞浸润、下调NF-κB和ICAM-1表达有关，而与银杏黄酮剂量可能无关。

【关键词】心肌再灌注损伤；银杏黄酮；大鼠；药理作用分子作用机制

赵艳荣，张国斌，邴飞虹.银杏黄酮对心肌缺血再灌注损伤大鼠的心肌保护作用及其作用机制研究[J].实用心脑肺血管病杂志，2016，24(3)：38-42.[www.syxnf.net]

Zhao YR，Zhang GB，Bing FH.Cardioprotective effects of ginkgetin on myocardial ischemia/reperfusion injury in rats and the action mechanism[J].Practical Journal of Cardiac Cerebral Pneumal and Vascular Disease，2016，24(3)：38-42.

银杏黄酮(ginkgetin)系中药银杏叶的活性成分，具有抗炎、抗氧化、扩张血管、抑制血小板聚集及神经保护等药理作用[1-3]。有研究显示，银杏黄酮对缺血再灌注心肌具有保护作用[4]，但其具体作用机制目前尚未明确。本研究拟制备心肌缺血再灌注(myocardial ischemia/reperfusion，MI/R)损伤大鼠模型，以细胞间黏附分子-1(ICAM-1)和核转录因子κB(NF-κB)为切入点，旨在探讨银杏黄酮对MI/R损伤大鼠的心肌保护作用及其作用机制。

1材料与方法

1.1实验动物SD大鼠40只，雌雄各半，平均体质量(200±20)g，由华中科技大学实验动物中心提供，许可证号：SCXK(鄂)2010-0009。

1.2主要药品和试剂银杏黄酮(黄酮含量≥24%)由西安润堡生物科技有限公司提供，以1%二甲基亚砜(DMSO)配成所需浓度(100 mg/kg和200 mg/kg)；氯化硝基四氮唑蓝(NBT)、髓过氧化物酶(MPO)试剂盒均购自南京建成生物工程研究所；NF-κB p65多克隆一抗、过氧化物酶标记的羊抗兔IgG二抗、ICAM-1多克隆抗体试剂盒、链霉亲和素-生物素复合物(SABC)法免疫组织化学试剂盒均购自武汉博士德生物工程有限公司。

1.3方法

1.3.1分组将80只大鼠随机分为假手术组、模型组、银杏黄酮低剂量组和银杏黄酮高剂量组，各20只。假手术组开胸但不结扎冠状动脉，腹腔注射等体积1% DMSO；模型组制备MI/R损伤模型，腹腔注射等体积1% DMSO；银杏黄酮低剂量组制备MI/R损伤模型，腹腔注射100 mg/kg银杏黄酮10 ml/kg；银杏黄酮高剂量组制备MI/R损伤模型，腹腔注射200 mg/kg银杏黄酮10 ml/kg。4组大鼠均于术前1周开始给药，1次/d。

1.3.2制备MI/R损伤模型采用冠状动脉结扎手术制备模型，在参考文献[5]方法的基础上加以改进，具体如下：取动物，术前12 h禁食不禁水，麻醉后仰位固定，四肢连接ECG-1350P型十二导联心电图机。颈部做气管插管，连接DW-3000型动物人工呼吸机(潮气量为20 ml/kg，呼吸频率为60次/min)，于胸骨左旁第3、4肋间开胸，并撑开肋骨暴露心脏，将带线缝合针沿左心耳下缘冠状动脉前降支起始部约4 mm处穿过，进针深度约1 mm，置入一段直径为1.5 mm的乳胶管于缝合线下，然后结扎缝合线以造成心肌缺血。缺血约30 min观察到心电图T波高耸或ST段明显抬高后，松开缝合线再灌注2 h，观察到高耸的T波下降或抬高的ST段下降1/2以上即说明再灌注成功。

1.4观察指标再灌注成功后处死各组大鼠，并观察各组大鼠心肌梗死面积、心肌组织MPO活性及心肌组织NF-κB和ICAM-1表达情况。

1.4.1心肌梗死面积的检测方法每组随机选10只大鼠，取心脏，去除心房及脂肪组织，在冠状动脉结扎线下从心尖起将心室平行切成厚度相等的5片，置于0.1% NBT溶液37 ℃下染色15 min，正常心肌呈蓝色，梗死心肌呈灰白色。采集图像，通过Image-Pro Plus 7.0图像处理软件测算梗死区面积和心室总面积，并计算心肌梗死面积占心室总面积的百分比[6]。

1.4.2心肌组织MPO活性的检测方法取各组剩余10只大鼠部分心脏，0.9%氯化钠溶液清洗后，上自动匀浆机制成匀浆，3 500 r/min离心10 min，取上清液，采用比色法于Biomate-5型分光光度计460 nm下测定OD值，并计算MPO活性，操作步骤严格按照试剂盒说明书进行。

1.4.3心肌组织NF-κB和ICAM-1表达的检测方法取各组剩余10只大鼠心脏，0.9%氯化钠溶液清洗后，在冠状动脉结扎线下取心肌行冰冻切片，厚度8 μm，采用免疫组化法检测NF-κB和ICAM-1表达情况，操作步骤严格按照试剂盒说明书进行，以PBS代替一抗作为阴性对照。采集图像，采用Image-Pro Plus 7.0图像处理软件分析图像，其阳性追踪点为表达于细胞质或细胞核的棕黄色颗粒状物，并测量阳性染色区面积，结果以阳性区面积所占百分比(阳性染色区面积/视野面积)表示。

2结果

2.1心肌梗死面积占心室总面积的百分比假手术组大鼠心肌梗死面积占心室总面积的百分比为0，模型组大鼠心肌梗死面积占心室总面积的百分比为(39.87±7.23)%，银杏黄酮低剂量组大鼠心肌梗死面积占心室总面积的百分比为(33.60±6.05)%，银杏黄酮高剂量组大鼠心肌梗死面积占心室总面积的百分比为(31.54±7.92)%。4组大鼠心肌梗死面积占心室总面积的百分比比较，差异有统计学意义(F=3.37，P<0.05)；其中模型组大鼠心肌梗死面积占心室总面积的百分比高于银杏黄酮低剂量组和银杏黄酮高剂量组，差异有统计学意义(P<0.05)；银杏黄酮低剂量组和银杏黄酮高剂量组大鼠心肌梗死面积占心室总面积的百分比比较，差异无统计学意义(P>0.05，见图1)。

图1　4组大鼠心肌梗死面积占心室总面积的百分比比较

Figure1Comparisonofpercentageofmyocardialinfarctarea/totalventricleareaamongthefourgroups

2.2心肌组织MPO活性假手术组大鼠心肌组织MPO活性为(76.85±10.02)U/g，模型组大鼠心肌组织MPO活性为(460.55±92.78)U/g，银杏黄酮低剂量组大鼠MPO活性为(350.16±71.21) U/g，银杏黄酮高剂量组大鼠心肌组织MPO活性为(344.63±50.42)U/g。4组大鼠心肌组织MPO活性比较，差异有统计学意义(F=65.21，P<0.05)；其中模型组、银杏黄酮低剂量组和银杏黄酮高剂量组大鼠心肌组织MPO活性高于假手术组，模型组大鼠心肌组织MPO活性高于银杏黄酮低剂量组和银杏黄酮高剂量组，差异有统计学意义(P<0.05)；银杏黄酮低剂量组和银杏黄酮高剂量组大鼠心肌组织MPO活性比较，差异无统计学意义(P>0.05，见图2)。

注：MPO=髓过氧化物酶

图24组大鼠心肌组织MPO活性比较

Figure 2Comparison of MPO activity of myocardial tissues among the four groups

2.3心肌组织ICAM-1和NF-κB表达情况4组大鼠心肌组织ICAM-1阳性区面积所占百分比和NF-κB阳性区面积所占百分比比较，差异有统计学意义(P<0.05)；其中模型组、银杏黄酮低剂量组和银杏黄酮高剂量组大鼠心肌组织ICAM-1阳性区面积所占百分比和NF-κB阳性区面积所占百分比高于假手术组，模型组大鼠心肌组织ICAM-1阳性区面积所占百分比和NF-κB阳性区面积所占百分比高于银杏黄酮低剂量组和银杏黄酮高剂量组，差异有统计学意义(P<0.05)；银杏黄酮低剂量组和银杏黄酮高剂量组大鼠心肌组织ICAM-1阳性区面积所占百分比和NF-κB阳性区面积所占百分比比较，差异无统计学意义(P>0.05，见表1、图3)。

本文要点：①药物预处理通过直接激活机体自身保护机制或促进机体释放生物活性物质而发挥心肌保护作用；②银杏黄酮通过抑制中性粒细胞浸润、下调NF-κB和ICAM-1表达而发挥心肌保护作用；③银杏黄酮对MI/R损伤的心肌保护作用可能与用药剂量无关。

Table 1Comparison of percentage of ICAM-1-，NF-κB-positive area/total myocardial tissue area among the four groups

组别只数ICAM-1阳性区面积所占百分比NF-κB阳性区面积所占百分比假手术组109.87±2.556.16±1.94模型组1038.45±10.20a65.79±15.40a银杏黄酮低剂量组1026.03±9.01ab49.86±11.13ab银杏黄酮高剂量组1020.17±3.66ab38.95±15.02abF值27.7443.10P值<0.001<0.001

注：ICAM-1=细胞间黏附分子-1，NF-κB=核转录因子κB;与假手术组比较，aP<0.05；与模型组比较，bP<0.05

注：ICAM-1=细胞间黏附分子-1，NF-κB=核转录因子κB

图34组大鼠心肌组织ICAM-1和NF-κB阳性区面积所占百分比比较

Figure 3Comparison of percentage of ICAM-1-，NF-κB-positive area/total myocardial tissue area among the groups

3讨论

药物预处理对MI/R损伤的心肌保护作用机制为药物直接激活机体自身保护机制或促使机体释放生物活性物质，进而增强损伤心肌组织对缺血、缺氧的耐受[7]。本研究旨在观察银杏黄酮对MI/R损伤大鼠的心肌保护作用，结果表明银杏黄酮能有效缩小心肌梗死面积，与陈健康等[4]研究结果相一致。有研究显示，以中性粒细胞浸润为主的炎性反应是导致MI/R损伤的重要原因之一[8]，MI/R损伤发生时激活的中性粒细胞聚集到心肌组织，通过一系列病理反应引起心肌细胞损伤及其功能丧失，如释放细胞毒性产物及炎性递质，直接损伤心肌；黏附于微循环，阻塞毛细血管，造成“无复流现象”；释放氧自由基，增强脂质过氧化反应，导致内皮细胞功能障碍等[9]。据报道，抑制中性粒细胞浸润能有儿降低MI/R损伤程度，因此抗中性粒细胞治疗可能成为防治MI/R损伤的有效措施[10]。MPO是中性粒细胞特有的一种酶，且MPO活性可判断中性粒细胞浸润程度。本研究结果显示，再灌注成功后，模型组、银杏黄酮低剂量组和银杏黄酮高剂量组大鼠心肌组织MPO活性高于假手术组，模型组大鼠心肌组织MPO活性高于银杏黄酮低剂量组和银杏黄酮高剂量组，而银杏黄酮低剂量组和银杏黄酮高剂量组大鼠心肌组织MPO活性间无差异。表明缺血再灌注损伤后心肌组织MPO活性明显升高，提示中性粒细胞浸润明显；且银杏黄酮可降低心肌组织MPO活性。

临床研究表明，ICAM-1在MI/R损伤的病理机制中发挥着重要作用，正常情况下心肌细胞仅表达极少量的ICAM-1；但当MI/R损伤发生时，心肌细胞中ICAM-1表达量会成倍增加[11]，且心肌细胞中ICAM-1高表达可刺激中性粒细胞与血管内皮细胞黏附，介导中性粒细胞对心肌组织的浸润，从而导致心肌细胞受损、凋亡[12]。据报道，ICAM-1的表达在MI/R损伤家兔再灌注120 min时开始升高，并与中性粒细胞浸润程度相关[13]，因此ICAM-1可能成为防治心肌缺血疾病的一个理想靶点[14]。本研究结果表明，模型组、银杏黄酮低剂量组和银杏黄酮高剂量组大鼠心肌组织ICAM-1阳性区面积所占百分比高于假手术组，模型组大鼠心肌组织ICAM-1阳性区面积所占百分比高于银杏黄酮低剂量组和银杏黄酮高剂量组，而银杏黄酮低剂量组和银杏黄酮高剂量组大鼠心肌组织ICAM-1阳性区面积所占百分比间无差异。表明MI/R损伤后心肌组织ICAM-1表达明显升高，且高、低剂量银杏黄酮均可通过降低心肌组织ICAM-1的表达而减少中性粒细胞在心肌积聚，从而改善心肌灌注。

临床研究表明，NF-κB可调控多种炎性相关蛋白基因的表达，正常情况下NF-κB以非活性状态存在于细胞质中；当MI/R损伤发生时，NF-κB活化并进入细胞核，进而调控一系列炎性递质基因的表达，如ICAM-1、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白介素1(IL-1)、白介素6(IL-6)等，以上炎性递质又会进一步激活NF-κB，形成恶性循环[15]。据报道，MI/R损伤大鼠心肌组织NF-κB p65蛋白表达量于再灌注60 min时达高峰，再灌注120 min时依然维持在高水平[16]，可见NF-κB被激活后启动多种炎性递质的表达是MI/R损伤的重要机制之一。本研究结果显示，模型组、银杏黄酮低剂量组和银杏黄酮高剂量组大鼠心肌组织NF-κB阳性区面积所占百分比高于假手术组，模型组大鼠心肌组织NF-κB阳性区面积所占百分比高于银杏黄酮低剂量组和银杏黄酮高剂量组，而银杏黄酮低剂量组和银杏黄酮高剂量组大鼠心肌组织NF-κB阳性区面积所占百分比间无差异。表明MI/R损伤后心肌组织NF-κB p65蛋白表达明显升高，且高、低剂量银杏黄酮均可降低心肌组织NF-κB p65蛋白的表达。

综上所述，银杏黄酮对MI/R损伤大鼠心肌具有保护作用，其作用机制可能与抑制中性粒细胞浸润、下调NF-κB和ICAM-1表达有关，而与银杏黄酮剂量可能无关。

作者贡献：赵艳荣负责实验实施、资料收集整理、撰写论文；张国斌负责实验评估、资料收集、数据统计分析；邴飞虹负责实验设计、论文审校并对文章负责。

本文无利益冲突。

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(本文编辑：谢武英)

Cardioprotective Effects of Ginkgetin on Myocardial Ischemia/Reperfusion Injury in Rats and the Action Mechanism

ZHAOYan-rong，ZHANGGuo-bin，BINGFei-hong.DaoyitangHospitalofTraditionalChineseMedicineofWuhan，Wuhan430000，China

【Abstract】ObjectiveTo investigate the cardioprotective effects of ginkgetin on myocardial ischemia/reperfusion injury in rats and the action mechanism.MethodsA total of 80 rats were randomly divided into A group，B group，C group and D group，each of 20 rats.Myocardial ischemia/reperfusion injury model was made by 30-minute ligation of left anterior descending branch and 2-hour reperfusion，rats of A group received intraperitoneal injection of 1% DMSO without ligation of left anterior descending branch，of B group received intraperitoneal injection of 1% DMSO after the preparation of the model，of C group received intraperitoneal injection of 100 mg/kg ginkgetin(10 ml/kg)，of D group received intraperitoneal injection of 200 mg/kg ginkgetin(10 ml/kg).Rats of the four groups received intraperitoneal injection before 1 week of the preparation of the model，1 time per day.All of the rats were killed after successful reperfusion，percentage of myocardial infarct area/total ventricle area，MPO activity and percentage of ICAM-1-，NF-κB-positive area/total myocardial tissue area were compared among the four groups.ResultsThe percentage of myocardial infarct area/total ventricle area of B group was statistically significantly higher than that of C group，of D group，respectively(P<0.05)；while no statistically significant differences of percentage of myocardial infarct area/total ventricle area was found between C group and D group(P>0.05).The MPO activity of B group，of C group，of D group was statistically significantly higher than that of A group，respectively，and MPO activity of B group was statistically significantly higher than that of C group，of D group，respectively(P<0.05)；while no statistically significant differences of MPO activity was found between C group and D group(P>0.05).The percentage of ICAM-1-，NF-κB-positive area/total myocardial tissue area of B group，of C group，of D group was statistically significantly higher than that of A group，respectively，percentage of ICAM-1-，NF-κB-positive area/total myocardial tissue area of B group was statistically significantly higher than that of C group，of D group，respectively(P<0.05)；while no statistically significant differences of percentage of ICAM-1-，NF-κB-positive area/total myocardial tissue area was found between C group and D group(P>0.05).Conclusion Ginkgetin has certain cardioprotective effects on myocardial ischemia/reperfusion injury in rats，the action mechanism is possibly correlated with inhibition of neutrephil infiltration，down-regulation of NF-κB and ICAM-1，is possibly not correlated with dose of ginkgetin.

【Key words】Myocardial reperfusion injury；Ginkgetin；Rats；Molecular mechanisms of pharmacological action

(收稿日期：2015-12-04；修回日期：2016-03-14)

【中图分类号】R 542.2

【文献标识码】A

doi:10.3969/j.issn.1008-5971.2016.03.011

通信作者：邴飞虹，430000湖北省武汉市，武汉道一堂中医医院；E-mail：bingfeihong@126.com

基金项目：国家自然科学基金(81102870)；湖北省民营中医医院重点专科项目(20140526)