天麻素对脑缺血再灌注损伤大鼠相关基因mRNA表达的影响

刘　波，丁利静，李　菲，龚其海

(1.遵义医学院 药理学教研室暨基础药理省部共建教育部重点实验室，贵州 遵义　563099；2.遵义医学院附属医院 药剂科，贵州 遵义　563099)



基础医学研究

天麻素对脑缺血再灌注损伤大鼠相关基因mRNA表达的影响

刘波1，丁利静2，李菲1，龚其海1

(1.遵义医学院 药理学教研室暨基础药理省部共建教育部重点实验室，贵州 遵义563099；2.遵义医学院附属医院 药剂科，贵州 遵义563099)

[摘要]目的 观察天麻素对脑缺血再灌注大鼠脑组织中缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)、血管内皮生长因子(VEGF)等基因mRNA表达的影响。方法 灌胃不同剂量天麻素7 d，采用线栓法制备大鼠大脑中动脉局灶性脑缺血(2 h)再灌注损伤模型，造模成功后继续给药7 d。采用实时荧光定量PCR(Real Time RT-PCR)法检测缺血半暗带脑组织中HIF-1α、VEGF、BDNF、MMP2、eNOS、PPARα 及SOD1 mRNA的表达。结果 天麻素可上调HIF-1α、VEGF、BDNF、MMP2、eNOS、PPARα、SOD1 mRNA的表达(P<0.05)，下调MMP2 mRNA的表达(P<0.05)。结论 天麻素可通过上调大鼠脑缺血半暗带HIF-1α、VEGF、BDNF、MMP2、eNOS、PPARα、SOD1 mRNA的表达，下调MMP2 mRNA的表达，产生抗局灶性脑缺血再灌注损伤的作用。

[关键词]天麻素；脑缺血再灌注；神经保护；大鼠；mRNA

脑缺血具有较高的发病率、致残率、死亡率及复发率的特点，因脑卒中而死亡的人数位居全球第3位，且呈逐年上升趋势[1]。脑缺血再灌注损伤(cerebral ischemia reperfusion injury, I/R)是脑缺血发病的重要病理生理环节，其病理生理学机制十分复杂，抑制I/R是降低脑缺血死亡率和致残率的关键。然而，迄今为止，在治疗学上尚无理想的治疗I/R的药物。故探索新的神经保护剂具有重要意义。天麻为贵州省道地药材，具有“息风止痉，平肝潜阳，祛风通络”等功效。天麻素(Gastrodine，Gas)是天麻的主要活性成分之一，现在药理学研究表明天麻素能够通过血脑屏障，在中枢神经系统的作用较为活跃，具有治疗心脑血管疾病、头痛、眩晕、癫痫和肌强直等作用[2-3]。既往实验研究显示天麻素可以通过抑制γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)降解酶、GABAA受体活性、抗炎、抗氧化、抑制凋亡等机制改善中动脉闭塞(middle cerebral artery occlusion, MCAO)所致局灶性脑缺血大鼠的神经功能、明显缩小梗死面积并降低脑含水量，对大鼠I/R有显著的保护作用[4-6]，但其保护机制尚不完全明了。因此，本研究拟在大鼠急性局灶性I/R损伤模型基础上，探讨天麻素对脑缺血半暗带缺氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、脑源性神经营养因子(brain derived neurotrophic factor,BDNF)、基质金属蛋白酶-2 (matrix metalloproteinase-2,MMP2)、内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)、过氧化物酶体增殖物激活受体α(peroxisome proliferators activated receptors,PPARα)、超氧化物岐化酶-1(superoxide dismutase-1，SOD1)mRNA表达的影响，旨在进一步探索天麻素保护I/R的机制，为临床治疗脑缺血性疾病提供实验和理论依据。

1材料与方法

1.1主要实验试剂天麻素(Gas)，南京泽朗医药科技有限公司，纯度≥98%；尼莫地平，山东鲁抗医药集团赛特有限责任公司；MCAO栓线，北京沙东生物技术有限公司；转录试剂盒，宝生物工程(大连)有限公司；GAPDH、HIF-1α、VEGF、BDNF、MMP2、eNOS、PPARα、SOD1 mRNA引物，宝生物工程(大连)有限公司；其它均为市售分析纯产品。

1.2仪器实时荧光定量PCR仪，美国BIO-RAD公司；逆转录仪，德国Eppendorf公司。

1.3实验动物清洁级SD大鼠90只，雄性，体重250～280 g，由第三军医大学大坪医院动物中心提供[许可证号：SCXK(渝)2007-0005]。光照/暗时间为12 h/12 h循环，自由饮食、饮水。

1.4方法

1.4.1实验分组大鼠分笼饲养，适应性喂养1周，随机分为6组，分别为假手术组(Sham)、模型组(Model)、Gas低、中、高剂量(记为Gas-L、Gas-M、Gas-H，剂量分别为15、30、60 mg/kg)组、阳性药组(Nim，12 mg/kg)，每组15只。分组前预防性灌胃给药7 d，假手术组、模型组给予等体积的双蒸水，制模成功后继续灌胃给药1周。动物饲养及实验过程均遵守实验动物管理与保护准则。

1.4.2大鼠脑缺血再灌注模型的制备7%的水合氯醛(0.5 mL/100g)腹腔注射麻醉，固定，参照Longa等[7]的方法，并加以改进制备大鼠右侧大脑中动脉阻塞模型[8]。分离右侧颈总动脉、颈外动脉、颈内动脉。MCAO栓线圆头端从颈总动脉插入颈内动脉 18～20 mm，感到阻力即表明栓线圆头已到达大脑中动脉起始端。2 h后，外拉栓线，实现大脑中动脉血液再灌。假手术组只结扎血管，不插栓线。

1.4.3实时荧光定量PCR(Real Time RT-PCR)检测脑缺血半暗带组织中HIF-1α、VEGF、BDNF、MMP2、eNOS、PPARα及SOD1 mRNA的表达每组取6只大鼠按试剂盒说明进行大鼠脑缺血半暗带RNA的提取，紫外分光光度计测量260、280 nm处吸光度(A)值，其A260/A280值为1.8～2.0。采用TaKaRa公司的RT试剂盒，在Eppend of Mastercycler Gradient PCR仪逆转录获得cDNA。以GAPDH作为内参基因，通过iCycler iQ real-time PCR仪进行扩增。引物序列(见表1)。以Ct值为统计参数依次计算下列数据：①Ctaverage=(Ct1+Ct2+Ct3)/3(重复管)，②dCt=Ctaverage-中间值，③基因的表达=2^(-dCt)，④以目的基因的表达/内参基因的表达进行HIF-1α、VEGF、BDNF、MMP2、eNOS、PPARα及SOD1mRNA的相对定量。

表1引物序列

基因上游引物(5'-3')下游引物(5'-3')HIF-1αCCAGATTCAAGATCAGCCAGCAGCTGTCCACATCAAAGCAGTACTCAVEGFGCCCATGAAGTGGTGAAGTTCAGATGTCCACCAGGGTCTCAABDNFGAAGGGCCAGGTCGATTAGGTGGACGGAAACAGAACGAACAGAAACAGMMP2CCAAGAACTTCCGACTATCCAATGACAGTGTAGGCGTGGGTCCAGTAeNOSAGATCCATGCAGACAGCCACAGAGGCTGGTACATGAGTTCAGAPPARαCTGACATTTGTGACTGGTCAAGCTCTTTCCAGGTCATCTGCTTCAAGTGSOD1AATGTGTCCATTGAAGATCGTGTGAGCTTCCAGCATTTCCAGTCTTTGTAGAPDHTAACCAGGCGTCCBATACGCAGTGCCAGCCTCGTCTCA

2结果

2.1Gas对MCAO大鼠脑组织HIF-1α、VEGF、BDNFmRNA表达的影响每组随机抽取6只大鼠缺血半暗带脑组织，Real Time RT-PCR法测定相关基因的mRNA表达。与假手术组相比，模型组HIF-1αmRNA表达明显增加(P<0.05)。与模型组相比，天麻素给药组HIF-1α、VEGF、BDNFmRNA的表达明显增加(P<0.05，见表2)。

2.2Gas对MCAO大鼠脑组织MMP2、eNOS、PPARα和SOD1 mRNA表达的影响每组随机抽取6只大鼠缺血半暗带脑组织，Real Time RT-PCR法测定相关基因的mRNA表达。与假手术组相比，模型组MMP2、eNOS、PPARαmRNA表达明显增加(P<0.05)，SOD1 mRNA表达明显减少(P<0.01)。与模型组相比，天麻素给药组eNOS、PPARα、SOD1 mRNA的表达明显增加(P<0.05)，天麻素高剂量给药组MMP2 mRNA的表达明显降低(P<0.05，见表2)。

处理HIF-1αVEGFBDNFMMP2eNOS PPARαSOD1Sham100±4100±43100±29100±22100±25100±37100±12 Model572±20##122±37106±31648±157##216±52##231±70#52±23##Nim765±27133±59109±40309±65*379±69*351±14*165±18**Gas-L930±41*202±63*119±33518±92690±179**633±78*95±21*Gas-M907±40*260±68*286±61*293±121426±12*1283±357* 366±110*Gas-H741±17*202±38*308±13*278±90*430±23*464±110*680±110*

##：与假手术组比，P<0.01;*：与模型组比，P<0.05；**：与模型组比，P<0.01。

3讨论

I/R后，由于缺血、缺氧引起神经细胞变性、坏死、 凋亡，导致神经功能受损。因此，改善缺血脑组织缺血、缺氧状态，是治疗脑缺血的有效方法之一[9-10]。

HIF-1α是大脑缺氧时机体产生的一种重要转录调节因子，对脑缺血后神经元的存活、凋亡及血管生成的调控产生重要作用。缺氧状态下，HIF-1α能通过调节各种靶基因的表达产生对缺氧的适应性反应，使缺氧的神经细胞保持一定的氧浓度，并诱导脑缺血耐受的形成，从而达到保护神经的作用[11-12]。VEGF、BDNF是HIF-1α众多靶基因中的2种重要的基因，其编码的蛋白参与血管新生与重塑、神经再生等过程[13]。VEGF是主要的调控血管生成的因子，它与内皮细胞VEGF受体相结合，在血管新生的早期发挥关键性作用，是整个脑缺血后血管新生调控的中心环节[14]。BDNF在脑组织中分布广泛，在病理状态下，它能减轻神经元的病理损伤、促进受损伤神经元再生、分化等。以往研究表明预防性给予BDNF可抑制Caspase-3激活，阻止缺血缺氧所引起的细胞凋亡，发挥神经保护作用[15]。本研究表明，Gas减轻脑缺血再灌注损伤可能与上调HIF-1α/VEGF/BDNF的基因表达有关。

PPARα在外周和脑内分布相当广泛[16]。PPARα受体激动剂可进一步抑制NF-κB的活性，具有抗氧化应激及抑制中枢神经系统炎症的作用[17-18]。I/R后会引起血脑屏障功能损害，血管通透性发生改变，使脑水肿症状明显。研究表明MMPs抑制剂能显著减轻缺血再灌注损伤后血脑屏障破坏及脑水肿的程度，同时，抑制慢性脑低灌注大鼠脑组织MMP2的表达，可保护血脑屏障，抑制神经细胞凋亡[19]。本研究表明，Gas能够上调PPARαmRNA的表达，同时，脑缺血再灌注损伤伴有MMP2 mRNA的高表达，而Gas可以通过抑制其高表达，从而起到保护缺血缺氧脑组织的作用。

eNOS及其产物对维持大脑血液供应和保护神经元起着重要作用。在eNOS敲除的转基因小鼠MCAO 模型中，可观察到其缺血区域的血液供应减少，脑梗死体积较野生型小鼠明显增加[20-21]。同时，自由基损伤也是脑缺血再灌注中重要的机制，Gas可以通过上调SOD等抗氧化酶治疗AD等中枢神经系统疾病[22]。本研究结果与报道一致。

脑缺血再灌注后，模型组HIF-1α、eNOS、PPARαmRNA表达明显上调[11]，可能与机体自身修复机制有关。再灌注损伤常伴有MMP2的高表达[23]，同时会产生诸多氧自由基，内源性自由基清除剂SOD1也将大量消耗[24]。本研究支持既往研究结果。

综上所述，Gas可通过促进HIF-1α、VEGF、BDNF、eNOS、PPARα及SOD1mRNA表达，抑制MMP2的释放发挥抗脑缺血再灌注损伤的作用。本研究从基因转录水平研究了Gas抗I/R的作用，为后续阐明其深入作用机制提供了重要线索。

[参考文献]

[1] Go A S. The epidemiology of atrial fibrillation in elderly persons: The tip of the iceberg[J]. Am J Geriatr Cardiol, 2005,14(2): 56-61.

[2] Lin L C, Chen Y F, Lee W C, et al. Pharmacokinetics of gastrodin and its metabolite p-hydroxybenzyl alcohol in rat blood, brain and bile by microdialysis coupled to LC-MS/MS[J]. J Pharm Biomed Anal, 2008, 48(3): 909-917.

[3] Kumar H, Kim I S, More S V , et al. Gastrodin protects apoptotic dopaminergic neurons in a toxin-induced Parkinson’s disease model[J]. Evid-Based Compl Alt, 2013, doi: 10.1155/2013/514095.

[4] 聂晶，杜亮，黄燮南，等. 天麻素对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用[J]. 华西药学杂志, 2010, 25(4): 423-425.

[5] 聂晶，杜亮，陆远富，等. 天麻素对脑缺血再灌注损伤大鼠神经细胞凋亡的抑制作用[J]. 重庆医学, 2012, 41(18): 2841-2842.

[6] Chik S C, Or T C, Luo D, et al. Pharmacological effects of active compounds neurodegenerative disease with gastrodia and uncaria decoction, a commonly used poststroke decoction[J]. The Scientific World Journal, 2013,doi:10.1155/2013/896873.

[7] Longa E Z, Weinstein P R, Carlson S, et al. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats[J]. Stroke,1989, 20(1): 84-94.

[8] 刘波, 李菲, 王丽娜, 等. 改良线栓法制备SD大鼠局灶性脑缺血再灌注模型研究[J]. 现代医药卫生, 2016, 2(32): 161-163.

[9] Zhang Z G，Zhang L，Jiang Q，et al. VEGF enhances angiogenesis and promotes blood-brain barrier leakage in the ischemic brain[J]. J CIin Invest, 2000, 106(7): 829-838.

[10] Emanueli C，Madeddu P. Angiogenesis gene therapy to rescue ischemic tissues: achievements and future directions[J]. Br J Pharmacol, 2001,133(7): 951-958.

[11] 刘波，龚其海. 缺氧诱导因子-1：神经保护的潜在靶标[J]. 遵义医学院学报，2012, 35(5): 452-457.

[12] 刘波，石京山，龚其海. 缺氧诱导因子-1的稳定性调节[J]. 遵义医学院学报，2012, 35(6): 548-552.

[13] Takeshi M, Tatsuya A, Jian Liang W, et al. Hypoxia- inducible factor -1α DNA induced angiogenesis in a rat cerebral ischemia mode1[J]. Neurol Res, 2005, 27(5): 503-508.

[14] Dombrowski S M, Deshpande A, Dingwall C, et al. Chronic hydrocephalus-induced hypoxia: increased expression of VEGFR-2 + and blood vessel density in hippocampus[J]. Neuroscience, 2008,152 (2): 346-359.

[15] Han B H, D'Costa A, Back S A, et al. BDNF blocks caspase-3 activation in neonatal hypoxia-ischemia[J]. Neurobiol Dis, 2000, 7(1): 38-53.

[16] Moreno S, Farioli-Vecchioli S, Ceru M P. Immunolocalization of peroxisome proliferators-activated receptors and retinoid X receptors in the adult rat CNS[J]. Neuroscience, 2004, 123(1): 131-145.

[17] Wayman N S, Hattori Y, McDonald M C, et al. Ligands of the peroxisome proliferator-activated receptors (PPAR-γ and PPAR-α) reduce myocardial infarct size[J]. FASEB J, 2002,16(9):1027-1040.

[18] Abdelrahman M, Sivarajah A, Thiemermann C. Beneficial effects of PPAR-γ ligands in ischemia-reperfusion injury, inflammation and shock[J]. Cardiovasc Res, 2005, 65(4): 772-781.

[19] Wei L, Han B H, Li Y, et al. Cell death mechaniam and protective effect of erythropoictin after focalischemia in the whisker barrel cortex of neonatal rat[J]. J Pharmacol Exp Ther, 2006, 317(1): 109-116.

[20] Koti R S, Tsui J, Lobos E, et al. Nit ricox ide synthase dist ribut ion and expressi on with isch emic precondit ioning of the rat liver[J]. FASEB J, 2005, 19(9): 1155-1157.

[21] Osuka K, Watanabe Y, Usuda N, et al. Modificat ion of endothelial NO synthase through protein phosphorylation after for brain cerebral ischemia/reperfusion[J]. Stroke, 2004, 35(11): 2582-2586.

[22] Peng Z, Wang S, Chen G, et al. Gastrodin alleviates cerebral ischemic damage in mice by improving anti-oxidant and anti-inflammation activities and inhibiting apoptosis pathway[J]. Neurochem Res, 2015, 40(4): 661-673.

[23] 刘丹, 刘国荣. 基质金属蛋白酶2与脑梗死[J]. 医学综述, 2009, 15(13): 1941-1944.

[24] 廖霖, 赵万, 张帆, 等. 盐酸戊乙奎醚注射液对大鼠急性全脑缺血再灌注后超氧化物歧化酶和丙二醛的影响[J]. 检验医学与临床, 2013, 10(20): 2756-2758.

[收稿2016-01-07;修回2016-03-04]

(编辑：王静)

Effect of Gastrodin on related genes mRNA expressions in cerebral ischemia-reperfusion rats

LiuBo1,DingLijing2,LiFei1,GongQihai1

(1.Department of Pharmacology and Key Laboratory of Basic Pharamacology of Ministry of Education, Zunyi Medical University, Zunyi Guizhou 563099, China; 2.Department of Pharmacy,Affiliated Hospital of Zunyi Medical University, Zunyi Guizhou 563099, China)

[Abstract]Objective To explore the effects of Gastrodin (Gas) on the mRNA expressions of hypoxia inducible factor-1α (HIF-1α), vascular endothelial growth factor (VEGF) and other genes in the ischemic penumbra of rats injured by ischemia (2 h)-reperfusion (I/R). Methods Rats were pretreated with Gas for 7 days followed by the focal cerebral I/R and then Gas was withdrawn 7 days after the I/R surgery. The mRNA expressions of HIF-1α, VEGF, brain derived neurotrophic factor (BDNF), matrix metalloproteinase-2 (MMP2), endothelial nitric oxide synthase (eNOS), peroxisome proliferators activated receptors (PPARα) and superoxide dismutase-1 (SOD1) in the ischemic penumbra of rats were detected by Real Time RT-PCR.Results The expressions of HIF-1α, VEGF, BDNF, MMP2, eNOS, PPARα and SOD1 mRNA in Gas group increased obviously (P<0.05), while the expression of MMP2 mRNA in Gas group decreased obviously (P<0.05).Conclusion Gas has protective effects on I/R-injured rat brain by up-regulating the expressions of HIF-1α, VEGF, BDNF, eNOS, PPARα and SOD1 and down-regulating the expression of MMP2.

[Key words]Gastrodin; cerebral ischemia-reperfusion; neuroprotection; rat; mRNA

[中图法分类号]R972

[文献标志码]A

[文章编号]1000-2715(2016)02-0139-04

[通信作者]龚其海，男，博士，教授，硕士生导师，研究方向：神经药理学，E-mail:gqh@zmc.edu.cn。

[基金项目]贵州省社会攻关计划项目(NO：黔科合SY字20083040)；贵州省科学技术基金资助项目(NO：黔科合JZ字[2014]2015)。