caspase-3限制小鼠脑卒中恢复期齿状回神经前体细胞增殖

朱西民　戴义芹　徐昊辰　孙春刚　范文英　赵冰樵△

(1复旦大学基础医学院医学神经生物学国家重点实验室,2复旦大学脑科学研究院脑科学协同创新中心　上海　200032)

caspase-3限制小鼠脑卒中恢复期齿状回神经前体细胞增殖

朱西民1,2▲戴义芹1,2▲徐昊辰1,2孙春刚1,2范文英1,2赵冰樵1,2△

(1复旦大学基础医学院医学神经生物学国家重点实验室,2复旦大学脑科学研究院脑科学协同创新中心上海200032)

【摘要】目的探讨caspase-3对脑卒中恢复期海马齿状回(dentate gyrus,DG)神经前体细胞(neuronal precursor cells,NPCs)增殖的作用。方法构建小鼠大脑中动脉远端堵塞(distal middle cerebral artery occlusion,dMCAO)缺血模型,取缺血手术后第7天缺血侧DG进行体外细胞培养。研究分为对照组和给药组(caspase-3抑制剂给药组);采用Western blot、免疫细胞化学、流式细胞仪和TUNEL染色检测DG NPCs中caspase-3的表达及NPCs的凋亡和增殖情况。在小鼠脑卒中后第14天,采用免疫组织化学方法检测caspase-3抑制对DG NPCs增殖的影响。结果体外培养的源自脑缺血后DG的神经球NPCs大量表达激活型caspase-3,但是超过87%的caspase-3阳性细胞与TUNEL阳性没有共定位关系。caspase-3限制了DG NPCs的自我更新,但并未参与细胞的凋亡过程。抑制caspase-3可促进脑卒中恢复期DG NPCs的增殖。结论caspase-3 可通过细胞凋亡之外的途径调控缺血性脑损伤后的神经再生。

【关键词】脑卒中;神经再生;caspase-3;齿状回;神经前体细胞;小鼠

脑卒中以其高发病率和高致残率的特点成为当前严重威胁人类健康的重大疾病[1]。脑卒中往往引起神经细胞的死亡和多种神经功能的退化与丧失,并且可导致患者的运动、感觉、语言和认知等功能受到不同程度的损害[2]。然而对于脑卒中所造成的神经功能障碍,临床上至今尚无有效的治疗手段。

在哺乳动物的侧脑室室管膜下区(subventricular zone,SVZ)和海马齿状回(dentate gyrus,DG)的颗粒细胞层(subgranular zone,SGZ)一直存在着神经发生。这一再生功能伴随于整个生命过程,对于脑结构和功能的可塑性以及记忆的形成具有重要影响。研究表明,脑缺血损伤可以刺激SVZ和DG区域神经细胞的增殖。新生的神经细胞迁移至损伤区周边或海马DG的SGZ,分化为成熟的神经元后参与脑组织的自我修复过程[3-8]。深入研究脑缺血损伤后神经细胞再生的机制,进而更好地促进神经元的有效新生,将为解决脑卒中后神经功能再塑的关键问题提供重要的理论依据。

caspase是一组在细胞凋亡中起核心作用的半胱氨酸蛋白酶,caspase-3 是caspase家族中最重要的凋亡执行者之一。caspase-3能够裂解大量特定的底物,激活核酸内切酶,最终导致细胞表现出染色质浓缩和核内DNA断裂等细胞凋亡的典型特征[9-11]。caspase-3还具有细胞凋亡以外的多种重要生物学功能,例如调节神经突触可塑性和T淋巴细胞的增殖以及参与单核细胞、成骨细胞、红细胞、角化细胞和造血干细胞等的分化过程[12-15]。国内外已有许多研究证实急性脑缺血或脑外伤引起激活型caspase-3在凋亡细胞中大量表达,而caspase-3基因敲除或caspase-3抑制剂对急性脑损伤均有非常明显的保护作用,急性脑损伤可以通过激活caspase-3的方式诱导神经元的凋亡[16-17]。然而,caspase-3在脑缺血损伤后DG的神经再生修复中起着何种作用,目前尚不清楚。

本研究发现caspase-3是缺血性脑卒中后调控DG神经再生的一种关键内源性分子,抑制caspase-3活性可促进脑卒中引起的DG神经前体细胞(neuronal precursor cells,NPCs)增殖。这些发现将有可能为促进脑卒中后的神经再生提供理论基础,并为开发脑卒中的治疗药物提供潜在的研究靶点。

材 料 和 方 法

实验动物C57BL/6J实验小鼠购自上海斯莱克实验动物有限公司。小鼠为8～10周龄,雄性,体质量为25～30 g,饲养于室温(22±2)℃、湿度55%±5%的清洁级环境中,12 h交换照明,小鼠自由进水进食。动物饲养及动物实验方案均严格按照复旦大学动物伦理委员会动物实验规范执行。

试剂和仪器BrdU和DMSO购自美国Sigma公司;4,6-diamino-2-phenylindole (DAPI) 购自美国Vector Laboratories公司;caspase-3抑制剂(Z-DEVD-fmk)购自美国Merck Millipore公司;TUNEL试剂盒购自瑞士Roche公司;Annexin V-FITC试剂盒购自美国BD Bioscience公司;鼠抗BrdU,兔抗激活型caspase-3购自英国Abcam公司;兔抗β-actin购自美国Cell Signaling Technology公司;山羊抗doublecortin(DCX)购自美国Santa Cruz公司;二抗购自美国Invitrogen公司。蛋白电泳系统和凝胶成像系统购自美国Bio-Rad公司;流式细胞仪购自美国Beckman Coulter公司;冰冻切片机购自德国Leica公司;激光共聚焦扫描显微镜购自日本Olympus公司。

小鼠脑缺血模型的建立动物实验得到复旦大学动物伦理委员会批准。参照文献[18-19]建造小鼠大脑中动脉远端堵塞(distal middle cerebral artery occlusion,dMCAO)缺血模型。小鼠经水合氯醛(360 mg/kg,腹腔注射)麻醉,仰卧位固定,行颈正中切口,钝性分离右侧颈总动脉。小鼠左侧卧,打开颅骨,挑开硬脑膜,暴露大脑中动脉,电凝大脑中动脉跨越嗅束后的远端。血管夹阻断右侧颈总动脉15 min,监测小鼠体温并维持在(37±0.5)℃。

caspase-3抑制剂注射小鼠脑缺血手术前10天,麻醉后(360 mg/kg水合氯醛腹腔注射)使用立体定位仪固定头部,按如下坐标埋入带微量进样针的套管：前囟后0.2 mm,左旁开0.9 mm,深1 mm。将caspase-3抑制剂Z-DEVD-fmk溶于DMSO,进一步在PBS中稀释(pH=7.4),在脑缺血后第3、6、9、12天,每天2次(间隔8 h)经侧脑室注射Z-DEVD-fmk(240 ng溶于2 μL 1.8% DMSO),对照组注射2 μL 1.8% DMSO[14]。脑卒中后早期给药会减少小鼠脑梗死[20],为排除Z-DEVD-fmk起神经保护作用的可能,在脑缺血后第3天开始注射Z-DEVD-fmk。对照组和给药组随机分配。

BrdU标记为了研究Z-DEVD-fmk对NPCs增殖的影响,在脑缺血后第5～13天,每天2次由腹腔注射BrdU(50 mg/kg)[21],每组6只小鼠。

神经球的培养根据文献报道[22],在脑缺血后第7天将小鼠麻醉,无菌条件下取全脑,分离缺血侧DG。分离出的组织用胰蛋白酶37℃水浴消化20 min,单细胞悬液以100×g离心5 min,用培养液重悬,将细胞密度调为1×104/mL,接种于经多聚赖氨酸处理的培养皿,置于37℃、含5% CO2的细胞培养箱内。收集原代培养获得的神经球,消化成单个细胞,将细胞悬液以1 000个/孔接种于96孔板中。培养基中加入25 μmol/L Z-DEVD-fmk或等量DMSO,7天后统计神经球数量。

Western blot检测收集培养的神经球,离心后加入含蛋白酶抑制剂和磷酸酯酶抑制剂的裂解液裂解,匀浆,提取蛋白,再离心,BCA法测定蛋白浓度。SDS-PAGE电泳,将蛋白条带转移至PVDF膜,含5%脱脂奶粉的封闭液封闭1 h,加入兔抗激活型caspase-3一抗,4 ℃过夜,加入二抗,37 ℃孵育1 h,加入显影液显色,在Bio-Rad自动凝胶成像系统中拍照,以β-actin为内参。

免疫细胞化学和TUNEL检测免疫细胞化学染色：将经过多聚赖氨酸和层粘连蛋白包被的盖玻片置于24孔板内,将神经球接种于盖玻片上,用预冷的4%多聚甲醛固定,10%驴血清封闭,加入兔抗激活型 caspase-3抗体,4℃过夜,PBS洗3次,加入荧光二抗(驴抗兔Alexa Fluro 594 IgG),室温反应30 min。按照相同步骤,进行Nestin染色。用DAPI标记细胞核。使用TUNEL试剂盒,按照说明书标记凋亡细胞。

流式细胞仪检测凋亡收集对照组和Z-DEVD-fmk处理7天的神经球,加入0.25%胰酶消化成单细胞,每组1×105细胞,加入锚定蛋白V-FITC和二碘化丙锭,避光反应15 min,用流式细胞仪(Epics Altra FACScan Flow Cytometer,美国Beckman Coulter公司)检测,采用EXPO32 V1.2 分析软件分析数据。

免疫组织化学小鼠脑缺血手术后第14天,深麻醉,用PBS和多聚甲醛灌流、取脑。脑组织经过多聚甲醛后固定、蔗糖梯度脱水,包埋,用冰冻切片机制备海马DG区冠状切片,切片厚度为20 μm。BrdU染色：切片经PBS洗涤3次,浸入2 mol/L HCl,37 ℃水浴30 min,洗涤后浸入3% H2O2室温避光反应20 min,0.1%胰酶修复20 min,封闭液封闭后,加入鼠抗BrdU抗体(1∶200),4 ℃过夜,洗涤后,加入辣根过氧化酶(horse radish peroxidase,HRP)标记的二抗室温孵育30 min,PBS漂洗,进行DAB显色[23],经光学显微镜成像分析。BrdU/DCX荧光双标记中,一抗分别为鼠抗BrdU抗体(1∶200)和山羊抗DCX抗体(1∶200),二抗为Alexa Fluor 488(1∶1 000)和Alexa Fluor 594(1∶1 000),通过激光共聚焦扫描显微镜观察和拍照。每个小鼠以1 mm的间隔取4张切片,通过Image J 软件计数细胞。

结果

体外培养的DGNPCs表达caspase-3通过Westernblot检测,我们发现,源于小鼠脑缺血后DG的神经球在不同时间点均能检测到激活型caspase-3,但是Z-DEVD-fmk处理组激活型caspase-3表达量明显偏低(图1A)。通过细胞免疫荧光染色发现,源于小鼠脑缺血后DG的神经球NPCs大量表达caspase-3(图1B),但是通过TUNEL标记发现,在激活型caspase-3阳性细胞中,TUNEL阳性率只有13%(图1C,D)。综上,我们初步得知源自脑缺血后DG的NPCs大量表达caspase-3,但caspase-3 的表达与细胞凋亡相关性不大。

图 1Caspase-3在体外培养DGNPCs中的表达

Fig1Caspase-3wasexpressedinculturedDGNPCsin vitro

Caspase-3限制DG NPCs的自我更新,但不参与细胞凋亡过程为进一步确定DG NPCs中,caspase-3与细胞凋亡的关系,我们采用流式细胞仪和TUNEL试剂盒检测了对照组和 Z-DEVD-fmk处理组细胞的凋亡情况。结果显示,两组的V-FITC阳性细胞率显著差异(图2A,B),两组的TUNEL阳性细胞率也无显著差异(图2C)。这说明在DG 来源的NPCs中,caspase-3没有发挥细胞凋亡作用。接下来,我们观察了对照组和 Z-DEVD-fmk处理组神经球的生长情况(图2D),并对两组神经球计数统计分析,发现两组神经球的数量差异有统计学意义(图2E)。这些表明caspase-3虽然限制DG NPCs的自我更新,但不参与诱导细胞凋亡。

Caspase-3对小鼠脑卒中恢复期DG NPCs增殖的调节作用我们前期的工作证明,海马DG区在生理情况下存在caspase-3激活的细胞,并且dMCAO缺血模型可增加caspase-3阳性细胞表达[24]。为阐明小鼠脑缺血恢复期caspase-3在DG NPCs中所起的作用,我们对小鼠进行dMCAO缺血手术,手术后的小鼠被随机分为对照组和Z-DEVD-fmk给药组,在脑缺血手术后第14天,收集脑组织。通过BrdU染色发现,Z-DEVD-fmk给药组DG的BrdU阳性细胞数比对照组增加42.2%,差异有统计学意义(图3A,C)。通过BrdU和DCX免疫荧光双标染色发现,Z-DEVD-fmk给药组DG BrdU阳性的NPCs数比对照组增加48.3%,差异有统计学意义(图3B,D)。

讨论

对于caspase-3在中枢神经系统病理过程中的作用,以往的研究大多关注其凋亡功能。而在本研究中,我们发现caspase-3限制脑缺血后DG来源神经球NPCs的自我更新,但是并不参与细胞的凋亡过程,还发现抑制caspase-3活性能促进脑卒中恢复期DG NPCs的增殖。

在脑缺血急性期,csapase-3表达增加,caspase-3去磷酸化形成激活型caspase-3,激活型caspase-3通过切割其作用底物,继而造成染色质浓缩、DNA 损伤以及细胞凋亡小体的产生,从而引起细胞凋亡。有研究证明,在脑缺血和脑外伤急性期,抑制caspase-3可明显减少神经元死亡,减轻脑损伤[6,17]。近年来也有研究发现,在细胞的增殖、分化,突触的可塑性变化和轴突的定向等方面,caspase-3也发挥了非凋亡的重要功能[12-13]。

本研究结果显示,激活型caspase-3在体外培养的DG NPCs中大量表达。我们采取TUNEL标记、免疫荧光染色及流式细胞仪检测等多种方法,发现caspase-3并未执行细胞凋亡的功能。通过Z-DEVD-fmk抑制caspase-3活性,可促进神经球的更新,并且显著增加小鼠脑缺血恢复期海马DG NPCs的增殖。结合以往的研究报道,我们发现,在脑卒中的疾病过程中,caspase-3可能扮演以下角色：在脑卒中急性期,caspase-3执行细胞凋亡的功能,造成神经元死亡;而在脑卒中恢复期,caspase-3抑制神经细胞增殖,进而影响损伤后脑功能的重塑。今后需要进一步研究caspase-3抑制是否能能够促进正常情况下DG NPC的增殖。

图2Caspase-3可调节DGNPCs的自我更新但不参与细胞凋亡

Fig2Caspase-3regulatedself-renewalofNPCsbutnotcelldeathinculturedDGNPCs

图3在小鼠脑缺血恢复过程中caspase-3对DGNPCs增殖的调节作用

Fig3Caspase-3negativelyregulatedDGNPCsproliferationinmiceduringstrokerecovery

脑卒中能够引起神经元的损伤和修复过程,因此增强内源性神经再生能力可能是治疗脑损伤的一条可行途径[25-26]。然而,仅仅依靠脑组织的自身修复,新生的神经元数目远远不能满足卒中后脑功能修复的需要。本研究结果表明,caspase-3限制脑卒中后内源性神经前体细胞的增殖,考虑到在脑缺血急性期caspase-3抑制对脑损伤具有保护作用,我们的研究结果将对开发脑卒中的新型治疗药物具有重要的参考意义。

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Restricted effect of caspase-3 on proliferation of neuronal precursor cells in dentate gyrus of mice during stroke recovery

ZHU Xi-min1,2▲, DAI Yi-qin1,2▲, XU Hao-chen1,2, SUN Chun-gang1,2,FAN Wen-ying1,2, ZHAO Bing-qiao1,2△

(1StateKeyLaboratoryofMedicalNeurobiology,SchoolofBasicMedicalSciences,2CollaborativeInnovationCenterforBrainScience,InstitutesofBrainScience,FudanUniversity,Shanghai200032,China)

【Abstract】ObjectiveTo investigate the effect of caspase-3 on the proliferation of neuronal precursor cells (NPCs) in the dentate gyruse (DG) during stroke recovery.MethodsThe stroke model was produced by electrocoagulating the distal middle cerebral artery (dMCA) of mice, then the NPGs were cultered from ischemia DG on the 7thday after stroke. Treatment groups and control groups were assigned in a randomized manner. The expression of caspase-3 and apoptosis and proliferation of NPCs were analyzed by Western blot, immunocytochemistry, flow cytometry analysis and TUNEL staining in NPCs cultured from ischemic DG. Besides, the effects of caspase-3 inhibition on the proliferation of NPCs in the DG was also investigated by immunohistochemistry in the mouse at 14 day after stroke.ResultsCaspase-3 was expressed in cultured NPCs,but more than 87% of the caspase-3 positive cells and TUNEL positive cells were not collocated. Caspase-3 negatively regulated self-renewal of NPCs,but did not participate in cell death in culture DG NPCs. Caspase-3 negatively regulated NPCs proliferation in the DG during stroke recovery.ConclusionsCaspase-3 may possess a novel function that limits the neurogenic response after stroke.

【Key words】stroke;neurogenesis;caspase-3;dentate gyruse;neural precursor cells;mouse

【中图分类号】R363

【文献标识码】A

doi:10.3969/j.issn.1672-8467.2016.03.005

(收稿日期:2015-09-15;编辑:段佳)

国家自然科学基金重点项目(81530034);国家自然科学基金面上项目(81071062,81271457)

△Corresponding authorE-mail:bingqiaoz@fudan.edu.cn

*This work was supported by the Key Program of National Natural Science Foundation of China (81530034) and the General Program of National Natural Science Foundation of China (81071062,81271457).