替硝唑栓微生物限度检查方法适用性试验研究

刘戈+邱唯佳+费夷敏

摘 要 目的：按照2015年版《中国药典》四部的要求进行替硝唑栓的微生物限度检查方法适用性试验研究。方法：采用改进的供试液制备方法、薄膜过滤法，进行3次独立平行试验。结果：计数法验证中， 5株菌（铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白假丝酵母、黑曲霉）的回收率比值均在0.5～2范围内；控制菌检查中，各阳性试验菌均检出，阴性对照均无菌生长。结论：替硝唑栓的微生物限度检查方法可行。

关键词 2015年版《中国药典》 替硝唑栓 适用性试验

中图分类号：R927.11 文献标识码：A 文章编号：1006-1533（2016）13-0073-04

Study on microbial limit test method for tinidazole suppositories

LIU Ge*， QIU Weijia， FEI Yiming

（Shanghai Shyndec Pharmaceutical Co. Ltd.， Shanghai 201802， China）

ABSTRACT Objective： To establish a method for the determination of the microbial limit test of tinidazole suppositories according to ChP 2015 Volume IV. Methods： Three parallel tests were carried out by applying an improved sample preparation method and membrane-filtering procedure. Results： The recovery rates of five microorganisms including Pseudomonas aeruginosa， Staphylococcus aureus， Bacillus subtilis， Candida albicans and Aspergillus niger were more than 50% and less than 200% by plate counting. Every positive test microorganism could be detected while negative control one could not grow in the examination of control microorganisms. Conclusion： This method for the microbial limit tests of tinidazole suppositories is feasible.

KEY WORDS ChP 2015； tinidazole suppositories； the suitability of the method

替硝唑栓具有抗原生动物和专性厌氧细菌的作用，适用于治疗滴虫性阴道炎及敏感厌氧菌所引起的细菌性阴道病，是妇科常用药物。该品与同类产品甲硝唑栓相比，其临床适应证相同，但疗效优于甲硝唑栓，不良反应明显少于甲硝唑栓，所以特别适用于经甲硝唑栓治疗疗效不明显或因不良反应难以接受甲硝唑栓治疗的患者。为有效控制药品质量，保证微生物限度检查方法的科学性和检验结果的准确性，根据2015年版《中国药典》四部微生物限度检查的新要求[1]，对替硝唑栓进行了微生物限度检查的方法适用性试验研究[2]。

1 材料和方法

1.1 培养基与试剂

胰酪胨大豆琼脂（TSA）、沙氏葡萄糖琼脂、胰酪胨大豆肉汤（TSB）、甘露醇氯化钠琼脂、溴化十六烷基三甲铵琼脂和沙氏葡萄糖肉汤均来源于上海中科昆虫生物技术开发有限公司。

1.2 菌种与样品

金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）CMCC（B）26003、铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）CMCC（B）10104、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）CMCC（B）63501、白假丝酵母（Candida albicans）CMCC（F）98001、黑曲霉（Aspergillus niger）CMCC（F）98003、大肠埃希菌（Escherichia coli）CMCC（B）44102均来源于上海市食品药品检验所。验证适用性试验所用的菌株传代均不超过5代，采用适宜的菌种保藏技术，以保证试验菌株的生物学特性。

替硝唑栓（上海现代制药股份有限公司，批号：151002、151003、151004，规格：1 g）。

1.3 仪器与设备

电动吸引器、微生物培养箱MJ-150-I型（上海齐欣科学仪器有限公司）；隔水式电热恒温培养箱GHP-9160型（上海齐欣科学仪器有限公司）；蒸汽灭菌器YXQLS-50SII型（上海博讯实业有限公司医疗设备厂）；药物天平BP-Ⅱ型（上海医用激光仪器厂）；滤器、净化工作台、微量移液器。

1.4 方法

1.4.1 微生物计数法验证

1.4.1.1 菌液及孢子悬液的制备

大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌和铜绿假单胞菌在胰酪大豆胨液体培养基中于30～35 ℃静止培养18～24 h，白假丝酵母在沙氏葡萄糖液体培养基于20～25 ℃静止培养24～48 h，分别取少量菌液，加pH 7.0无菌氯化钠蛋白胨溶液，制成适宜浓度的菌悬液进行活菌计数。

黑曲霉先在斜面培养基上于20～25 ℃培养5～7 d，然后加0.9%无菌氯化钠溶液3～5 ml洗脱孢子制成孢子悬液，取少量用0.9%无菌氯化钠溶液稀释成适宜浓度进行活菌计数。

1.4.1.2 供试液的制备

取供试品20 g（验证批号为替硝唑栓：151002、151003、151004）至含无菌十四烷酸异丙酯40 ml中[3]，振摇，使供试品完全溶解，然后加入45 ℃ pH 7.0无菌氯化钠蛋白胨溶液200 ml，混匀，萃取，静置，使明显分层，用分液漏斗取水相，分装9.9 ml若干份作为1∶10的供试液备用[4-5]。

试验组取备用供试液1 ml，加入无菌pH 7.0氯化钠蛋白胨溶液500 ml混匀，注入开放式滤器无菌过滤（Millipore混合纤维素酯滤膜，孔径0.45 mm）[6]。用无菌pH 7.0氯化钠蛋白胨溶液冲洗滤膜，每次用量100 ml，总量为500 ml[7]。在最后100 ml冲洗液中加入上述试验微生物（金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白假丝酵母、黑曲霉）菌液0.1 ml，平行制备2份。将含细菌和真菌的滤膜分别反贴于0.2%卵磷脂和2%聚山梨酯80胰酪胨大豆琼脂（TSA）和沙氏葡萄糖琼脂平皿上，于规定温度培养并观察结果[8]，分别作为计数法验证中需氧细菌和真菌总数计数法适用性试验。

菌液对照组取不含中和剂及灭活剂的相应稀释液替代供试液，按试验组操作加入试验微生物并进行微生物回收试验[试验组菌回收率=（试验组菌落数-供试品对照组菌落数）/菌液对照组菌落数]。

供试品对照组取备用供试液，以稀释液代替菌液同试验组操作。

中和剂对照组取相应量稀释液替代供试液，按试验组操作加入试验微生物并进行微生物回收试验。

1.4.2 控制菌检查法验证

1.4.2.1 供试品的制备

同1.4.1.2项操作至萃取，静置，使明显分层，用分液漏斗取水相，作为1∶10的供试液，备用。

1.4.2.2 试验组

取三份供试液10 ml（1∶10），方法同1.4.1.2，用500 ml冲洗液冲洗，在最后100 ml冲洗液中加入试验菌（金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、白假丝酵母）菌液0.1 ml（含菌量不大于100 cfu），取出滤膜，分别接种于含0.1%卵磷脂和2%聚山梨酯80的TSB肉汤500 ml[9]、TSB肉汤100 ml和沙氏葡萄糖肉汤100 ml中，按规定方法培养后，分别取培养物划线接种，观察结果。

1.4.2.3 阴性对照组

取供试液10 ml（1∶10），在最后100 ml冲洗液中加入试验菌（大肠埃希菌）菌液0.1 ml（含菌量不大于100 cfu），作为上述3株菌的阴性对照，观察结果。

2 结果

2.1 微生物计数法验证

通过3次独立平行试验发现，5株试验组菌回收率均在0.5～2范围内（表1），该方法经验证可以作为供试品计数检查方法。其中中和剂对照组与菌液对照组的菌落数比值在0.5～2范围内，说明需氧菌总数计数法验证中培养基中加入的中和剂0.2%卵磷脂和2%聚山梨酯80对微生物无毒性，证明该中和剂可以适用。

2.2 控制菌检查法验证

通过3次独立平行试验（1、2、3次结果相同），从表3可以看出，各阳性试验菌均检出，阴性对照均无菌生长，故可按此供试液制备方法和控制菌检查法进行控制菌检查。

3 讨论

根据《中国药品检验标准操作规范》2010年版规定：由于某些供试品具有抗菌活性，在建立测定方法或原测定方法的检验条件发生改变时，可能影响检验结果的准确性，必须对供试品的抑菌活性及测定方法的可靠性进行验证，对试验菌的回收率应逐一进行验证。

替硝唑栓基质为混合脂肪酸甘油酯，属非水溶性基质，且该栓剂具有较强的抑菌作用[10]，故试验时需采用适合的方法，使非水溶性基质均匀分散在稀释剂中[11]，并消除供试品抑菌成分，才能真实地反映微生物污染的情况，便于检查。

十四烷酸异丙酯为目前药典允许使用的有机溶剂，其用法有明确的规定，在该品种供试液制备时，先用十四烷酸异丙酯使基质分散，再用稀释剂将样品萃取到水相，水相薄膜过滤后截留的微生物进行平板培养检测。为消除样品的抑菌活性，在验证时采用开放式滤器将贴膜法与薄膜过滤法联用、摸索出适宜的冲洗量和中和剂，个别菌采用培养基稀释法等消除供试品的抑菌性。

通过进行3次独立平行的替硝唑栓微生物限度检查方法的适用性试验研究，验证结果重现性好，在今后检测中可采用此方法检测微生物限度。

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