超声波辅助碱水提取杠板归中黄酮的工艺研究*

王　希，王宗成

(1 株洲市食品药品检验所，湖南　株洲　412000；2 湖南科技学院化学与生物工程学院，湖南　永州　425199)



超声波辅助碱水提取杠板归中黄酮的工艺研究*

王希1，王宗成2

(1 株洲市食品药品检验所，湖南株洲412000；2 湖南科技学院化学与生物工程学院，湖南永州425199)

采用超声波碱水提取杠板归中的总黄酮，并采用分光光度法，以芦丁为标准品测定杠板归中总黄酮的提取率。通过单因素实验分析了pH值，提取时间，料液比三个主要因素对黄酮提取的影响，并通过正交实验设计优化了杠板归中总黄酮提取条件。实验结果表明，杠板归中总黄酮超临界提取的最佳条件为pH值为9，时间为40 min, 料液比为1:50，该条件下杠板归中总黄酮的提取率为14.72 mg/g。

杠板归；总黄酮；超声波辅助提取

杠板归为蓼科植物杠板归的干燥地上部分，具有清热解毒、利水消肿、抗病毒、抗氧化、抗菌、抗炎、止咳祛痰、护肝、抗癌等作用[1]。临床上可用于肾炎水肿、百日咳、泻痢、湿疹、疖肿、毒蛇咬伤等[2]。黄酮类化合物具有抗癌、抗肿瘤、抗心脑血管疾病、抗炎镇痛、免疫调节、降血糖、治疗骨质疏松、抑菌抗病毒、抗氧化、抗衰老、抗辐射等功效[3]，因此，黄酮类化合物的功用引起了人们的广泛重视[4]。近几年来，从植物中提取分离黄酮化合物开发保健食品、化妆品的研究非常多[5-7]。杠板归主要含有黄酮类、蒽醌类、苯丙素糖酯类和其他类化合物[8]。从杠板归中得到的黄酮类化合物有山萘酚、槲皮素、蓄苷、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖醛酸甲酯、槲皮素-3-β-D-葡萄糖醛酸正丁酯、山萘酚-3-O-芸香糖苷、芦丁等[9]。黄酮类物质由于含有酚羟基呈弱酸性一般易溶于碱性溶液，所以在提取的时候可用碱性溶液提取能得到较高的提取率[10]。而超声辅助提取与常规浸泡提取法过程相比，超声空化作用加快了提取速度，缩短了提取时间，进而提高了天然产物中活性成分的提取率[11]。本试验基于当前研究状况和开发利用湖南当地植物资源，采用有利于工业化生产的超声提取方法提取杠板归中的黄酮，采用正交试验设计对杠板归黄酮提取工艺进行优化获得较佳工艺。以期将杠板归中的黄酮类化合物开发成抗氧化保健食品，为进一步开发利用杠板归提供理论依据。

1　实　验

1.1实验材料与试剂

实验材料为杠板归茎叶；芦丁(标准品)，中国药品生物制品检定所；95%乙醇、亚硝酸钠、氧化钙、硝酸铝，NaOH等试剂均为分析纯。

1.2主要仪器

超声波萃取器；旋转蒸发仪；离心沉淀器；电子天平；循环水式真空泵；UV-1750型紫外可见分光光度计，日本岛津公司。

2　结果与讨论

2.1标准溶液的配制

称取约50 mg芦丁标准品于称量瓶中置105 ℃烘箱下烘干至恒重，干燥器中冷却，精确称取25 mg芦丁标准品，用70%乙醇定容100 mL为标准液。

2.2黄酮含量测定标准曲线的绘制

精确量取1、2、3、4、5、6 mL芦丁标准液，分别置于25 mL容量瓶中，各加6 mL 70%乙醇溶液，再分别加5%亚硝酸钠溶液1 mL混匀，放置6 min，加10%硝酸铝溶液1 mL混匀，放置6 min，加氢氧化钠试液10 mL再加水至刻度，摇匀，放置15 min，以试剂空白作参比，用1 cm比色皿在510 nm波长处测定吸光度，计算标准液浓度(C)与吸光度(A)的回归方程A=bC+k，得到回归方程为：D=9.7829C+0.0199(R2=0.9987)。

2.3样品处理方法

将杠板归除去杂质、洗净、切碎，再在105 ℃烘至恒重。取出样品用滤纸包住，放入干燥器中冷却备用。

2.4黄酮的提取

碱性提取液选择价廉易得的石灰水。准确称取1.0 g剪碎的杠板归于250 mL烧杯中，按一定的料液比加入一定pH值的碱性Ca(OH)2溶液提取剂，浸泡2 h，超声波提取一定时间后过滤，残渣用少量提取剂洗涤3次，合并滤液, 定容于100 mL后，离心沉淀20 min，取上层清液10 mL，按照2.2分光光度法测定吸光度，计算总黄酮提取率。

2.5含量计算方法

按照标准曲线绘制方法操作，测定吸光度，根据标准曲线计算出测定样品溶液总黄酮浓度C。然后计算样品中总黄酮的提取率。

式中：C——测定样品溶液总黄酮浓度，mg/mL

N——稀释倍数

V——最初样品定容体积，mL

m——样品质量，g

2.6单因素实验

2.6.1pH值对杠板归黄酮提取率的影响

表1　pH值不同对总黄酮收率的影响

常温下，料液比1:40，不同pH值条件下(8，9，10，11，12)，超声波处理30 min，研究不同的pH值对杠板归总黄酮得率的影响，结果如表1所示，随着pH的增大，提取液的吸光光度值先增加，然后逐步降低，pH值为9时吸光光度值最大，相对应的提取率最高，考虑生产成本以及环保，大规模工业生产时，pH值不能高于9。

2.6.2超声提取时间对黄酮提取率的影响

常温下，pH为9的碱水液，料液比1:40，搅拌条件下超声辅助提取不同时间长度(20，30，40，50，60，70 min)，研究不同的提取时间对杠板归总黄酮得率的影响，结果如表2所示，随着超声时间的增加，吸光光度值增加缓慢，超声时间超过50 mim后吸光光度值迅速减少，即总黄酮收率降低。通过分析，发现30～50 min时提取率较高，为了节省时间，从工业成本和提取周期角度来看，超声时间不宜超过50 min。

表2　超声时间对总黄酮提取率

2.6.3料液比的选择

常温下，pH为9的碱水液，超声波处理时间为60 min，研究不同的料液比(1:20，1:30，1:40，1:50)对杠板归总黄酮得率的影响，结果如表3所示，开始时随着料液比的减少，提取液的吸光光度值逐步增加，当料液比为1:40时，吸光光度值提达到最大，此时相对应的提取率最高，继续减少料液比，吸光光度值反而有所减少，对总黄酮的提取不利。

表3　料液比对总黄酮收率的影响

2.7正交实验

在单因素的基础上，以pH值，超声提取时间，料液比为考察因素，利用正交试验设计方法设计三因素三水平的实验，共进行九次实验，从而确定超声辅助碱水提取杠板归中黄酮的最佳工艺条件[12]，正交试验因素与水平见表4。

表4　正交试验设计

正交试验结果见表5，因素A的极差最大，其次是因素B，因素C的极差最小。极差分析可知，三个因素的影响顺序为 A>B>C, pH对提取率影响最大，其次是超声辅助提取时间，料液比的影响最小。对于A因素有K2>K3>K1，对于B因素有K2>K1>K3，对于C因素有K3>K2>K1，由此可确定最佳条件为A2B2C3，即pH为9，超声提取时间40 min，料液比为1:50。

表5　正交实验结果

2.8验证实验

根据筛选得到的最佳提取条件：pH为9，超声提取时间40 min，料液比为1:50，平行提取3次，结果如表6所示。黄酮的提取率相比较最高，精密性较好，说明所得出的最佳工艺条件合理且具有较好的稳定性。

表6　验证性实验

3　结　论

本文通过单因素和正交实验，研究了pH，时间，料液比三个主要因素对黄酮提取的影响，结果表明：在影响杠板归中总黄酮提取率的三个提取条件中，pH影响最大，为最显著因子，其次为提取时间，料液比影响最小；杠板归中总黄酮的最佳工艺为：选用pH值为9的Ca(OH)2溶液，时间为40 min, 料液比为1:50，此时杠板归中总黄酮的提取率为14.72 mg/g。该工艺合理、简单、方便，也有利于工业化提取生产。

参考资料

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[2]张明,陈华国,赵超,等. 杠板归中总黄酮的含量测定[J]. 中国实验方剂学杂志, 2012, 18(18): 77-80.

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[4]彭程程,王青山, 赵国祥,等. 黄酮类化合物的研究进展[J]. 农产品加工(学刊), 2010(5): 38-41,43.

[5]黄池宝, 罗宗铭. 黄酮类化合物在食品中的应用[J]. 广州化工, 2000, 28(4): 35-37.

[6]陈晓慧, 徐雅琴. 黄酮类化合物生物活性及在食品中的应用研究[J]. 食品工程, 2006 (3): 12-14.

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[8]李敏,万远芳,郑文豪. 杠板归的研究进展[J]. 国际中医中药杂志, 2013, 35(8): 742-744.

[9]张荣林. 杠板归的化学成分研究[D]. 沈阳: 沈阳药科大学, 2007.

[10]赵洪,杨颖,黎李. 碱溶液提取竹叶总黄酮工艺的初步研究[J]. 山东化工, 2015, 44(13): 58-59.

[11]杨昱,白靖文,俞志刚. 超声辅助提取技术在天然产物提取中的应用[J]. 食品与机械, 2011, 27(1): 170-174.

[12]刘榕城,胡炜,邓光辉,等. 超声波法碱水提取叶下珠黄酮的研究[J]. 时珍国医国药, 2008, 19(7): 1599-1601.

Study on Ultrasonic-assisted Extraction Technology of Total Flavonoids from Leaves of Perfoliote Knotweed Herb*

WANG Xi1, WANG Zong-cheng2

(1 Zhuzhou Institute for Food and Drug Control, Hunan Zhuzhou 412000;2CollegeofChemicalandBiologicalEngineering,HunanUniversityofScienceandEngineering,HunanYongzhou425199,China)

Total flavonoids in leaves of Perfoliote Knotweed Herb were extracted by ultrasonic-assisted and its extraction yield was detected by spectrometric method with rutin as standard material. In the extracting process of total flavonoids, three factors, including pH, solid-liquid ratio and extraction time, were studied by single factor analysis method. Based on single factor test, the optimal extraction conditions of total flavonoids were determined by orthogonal test as follows: pH was 9，solid-liquid ratio was 1:50, in 40 min, the extraction yield of total flavonoids from leaves of Perfoliote Knotweed Herb was 14.72 mg/g by the optimal process.

Perfoliote Knotweed Herb; total flavonoids; ultrasonic-assisted extraction

湖南省教育厅资助科研项目(15C0587)。

王希(1990-)，男，硕士，主要从事药物合成及天然产物开发。

王宗成(1983-)，男，硕士，讲师。

R284.2

A

1001-9677(2016)016-0057-03