HBeAg阳性HBV携带者T淋巴细胞亚群状况研究

王维琼，张双喜，何国敏，邱庐山，郭洁仪

（广东省佛山市顺德区中医院内二科，广东 佛山 528300）

论 著

HBeAg阳性HBV携带者T淋巴细胞亚群状况研究

王维琼，张双喜，何国敏，邱庐山，郭洁仪

（广东省佛山市顺德区中医院内二科，广东 佛山 528300）

目的：分析HBeAg阳性HBV携带者和正常人外周血T细胞亚群的差异，探讨HBV携带者的发病机制与宿主细胞免疫功能的关系。方法：收集21例HBeAg阳性HBV携带者及22例正常人的外周血，检测T细胞亚群，分析其差异及临床意义。结果：HBeAg阳性HBV携带者的CD3+、CD4+、CD8+T淋巴细胞、CD4+/CD8+比值分别为（1302±132）个/µL、（675±152）个/µL、（578±154）个/µL、（1．5±0．3）；正常人群分别为（1502±395）个/µL、（880±267）个/µL、（609±189）个/µL、（1．4±0．4）。与正常对照组比较，HBeAg阳性HBV携带者外周血CD3+、CD4+、CD8+T淋巴细胞、CD4+/CD8+比值均减少，差异无统计学意义。结论：HBeAg阳性HBV携带者T淋巴细胞免疫功能减退，可能导致乙肝病毒感染后慢性化并且病素高度复制。

HBeAg阳性HBV携带者；T淋巴细胞亚群；临床研究

据世界卫生组织报道，全球约20亿人曾感染过慢性乙型肝炎病毒（HBV），我国人口中HBV感染率为6%，乙肝表面抗原阳性率约10%，据估计全国有1.2亿人为HBV携带者［1］。慢性HBV携带者因缺乏对HBV的特异性免疫清除，表现为血清HBsAg、HBeAg阳性，而且高病毒载量复制（≥1.0×l06IU/mL）。我们研究了HBeAg阳性HBV携带者与正常人T淋巴细胞亚群的差异，借以了解HBeAg阳性HBV携带者的细胞免疫功能状态，报道如下。

1　临床资料

21例均为2014年至2016年于我院就诊的HBeAg阳性HBV携带者，设正常人群对照组22例。两组年龄、性别基线特征相比较差异均无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。研究获得伦理委员会批准，受试者均签署知情同意书。

纳入标准：①HBeAg阳性慢性HBV携带者，符合《2010年慢性乙型肝炎防治指南》；②HBeAg阳性，HBV-DNA≥1.0×104IU/mL（相当于2000IU/Inl）；③丙氨酸转移酶（ALT）水平小于等于正常上限（ULN）；④年龄18～65岁；⑤肝功能处于代偿期（总胆红素小于等于34.2mmol/L，凝血酶原国际标准化比值小于等于1.5，白蛋白大于30.0g/L，无食管静脉曲张出血、肝性脑病史或腹水；⑥符合肾虚证候或体质；⑦签署知情同意书。

排除标准：①年龄18岁以下或65岁以上；②存在其它肝脏疾病；③有严重心、脑、肾、呼吸、血液和内分泌等疾病；④近期内有急、慢性胰腺炎病史；⑤滥用乙醇或非法药物史；⑥在30天内参加了其他肝炎药物的临床试验；⑦入选前24周内曾接受过干扰素、核苷酸类似物、胸腺肽或其他抗病毒药物治疗；⑧怀孕或哺乳期妇女；⑨不符合纳入标准，未按规定用药，无法判断疗效或资料不全等影响疗效和安全性观察。

2　试验设计

主要试剂及仪器：SEMIBIO CD细胞检测玻片，SEMIBIO cytoCounter系列全自动可视化细胞检测仪。

标本收集及检测。①标本：全部受检者用EDTAK2真空采血管早晨空腹采集静脉血2mL，6h内检测，严禁冷藏。②稀释血样：反吸法取20µL静脉血或手指末梢血加至380µL磷酸盐缓冲液（1包磷酸盐缓冲液粉剂加400mL蒸馏）中，充分混匀。③孵育：反吸法取5µL稀释血，加入玻片方框区域中央；湿盒内加入室温水，水平放置，孵育40min。④洗染：将玻片放至磷酸盐缓冲液中旋转提拉后，放至过氧化酶染色液（1包过氧化酶染色粉加500mL95%乙醇）中浸泡1min，再放至新鲜配制的过氧化氢工作液（1mL3%过氧化氢加400mL蒸馏水）中浸泡4min，再放至75%乙醇中旋转提拉至无色透明后取出，打开锁扣，干燥6min后放至复染液（1包复染粉加500mL75%乙醇）中浸泡1min，最后在500mL水中浸泡30s后提拉（大于15片提拉5次，小于15片提拉3次），然后打开锁扣，放入检测仪自动计数。

外周血T淋巴细胞亚群正常参考范围：CD3+细胞770～2860/µL，CD4+细胞500～440/µL，CD8+细胞238～1250/µL，CD4+/CD8+比值1.0～2.47。

采用SPSS17.0软件进行统计学处理，数据用（x±s）表示，正态分布且方差齐的多组均数比较采用方差分析和SNK-q检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

3　结 果

两组CD3+、CD4+、CD8+T淋巴细胞比较见表1。

表1　两组CD3+、CD4+、CD8+T淋巴细胞比较 （±s）

表1　两组CD3+、CD4+、CD8+T淋巴细胞比较 （±s）

注：与正常对照组比较，△P＜0.05。

组别　n　CD3+（个/µL）CD4+（个/µL）CD8+（个/µL） CD4+/CD8+HBV携带组 21　1302±132△675±152△　578±154△　1.5±0.3△正常对照组 22　1502±395　880±267　609±189　1.4±0.4

4　讨 论

慢性HBV携带者对抗病毒治疗反应欠佳，源于其自身的免疫耐受。研究表明，乙肝病毒感染后HBV特异性T淋巴细胞亚群（CD4+、CD8+及CD4+/CD8+比值）在对病毒的清除和疾病的转归中起着重要的作用［2］。T淋巴细胞表达CD3+分化抗原，再根据细胞表面黏附分子（CD）的不同，分为CD4+、CD8+等T淋巴细胞亚群。CD4+T淋巴细胞通过辅助体液免疫细胞，产生抗体和细胞毒性杀伤作用来清除HBV，其水平下降是HBV感染慢性化的重要原因。CD8+T淋巴细胞是清除HBV的主要效应T细胞，免疫耐受期HBV病毒不断复制，引起CD8+T淋巴细胞的细胞毒作用随病毒水平的增高而增强，免疫耐受被打破，进入免疫清除期，降低HBV-DNA复制水平，故免疫耐受期CD8+T淋巴细胞不同亚群的细胞毒作用均低于免疫清除期［3］。

实验结果显示，HBV携带者的CD3+、CD4+、CD8+T淋巴细胞、CD4+/CD8+比值均低于正常对照组，提示该人群细胞免疫功能下降，导致感染HBV后乙肝病毒不易清除，疾病呈慢性化发展。提示在对慢性HBV携带者抗病毒治疗中，应同时考虑调节免疫，增强T淋巴细胞的免疫作用，从而最终清除HBV感染的靶细胞，并彻底消除HBV感染。

［1］ LAVANCHY D ．Hepatitis B virus epidemiology，disease burden，treatment，and current and emerging prevention and control measures［J］．J Viral Hepat，2004，11：97-107．

［2］ 张敏，杨丽莎，彭德珍，等．慢性HBV感染不同免疫状态及乙肝肝硬化外周血T、B细胞亚群和NK细胞的变化及意义［J］．实用医学杂志，2014，30 （20）：3233-3236．

［3］ THIMME R，WIELAND S，STEIGER C， et a1．CD8（+）T cells mediate viral clearance and disease pathogenesis during acute hepatitis B virus infection［J］．J Virul，2003，77：68-76．

HBV carrier with HBeAg positive；T-lymphocyte subsets；clinical study

R512.62

B

1004-2814（2016）08-0751-02

2016-04-14

广东省中医药局科研课题（20151153）

［Abstract］Objective：To analysis the difference of T-lymphocyte subsets between the HBV carriers with HBeAg positive and normal persons and to discuss the relationship between the pathogenesis and host cells immune function of HBV carriers. Method： Peripheral blood of 21 cases of HBV carriers with HBeAg positive and 22 cases of normal persons was collected to detect T-lymphocyte subsets and analysis the difference and clinical significance. Result： CD3+， CD4+ and CD8+ T-lymphocyte and the ratio of CD4+/CD8+ of HBV carriers with HBeAg positive was （1302±132）/µL，（675±152）/µL，（578±154）/µL and （1.5±0.3）respectively while that of the normal persons was （1502±395）/µL，（880±267）/µL，（609±189）/µL and （1.4±0.4）respectively. Compared with that of the normal control group， CD3+， CD4+ and CD8+ T-lymphocyte and the ratio of CD4+/CD8+ in peripheral blood of HBV carriers with HBeAg positive decreased， with no statistical significance. Conclusion：T-lymphocyte immunologic decline of HBV carriers with HBeAg positive may be related to active replication of hepatitis B virus after HBV infection.