绿色甜菊糖制备工艺的研究及主要成分分析

王姣姣

(天津中德职业技术学院, 天津 300350)



绿色甜菊糖制备工艺的研究及主要成分分析

王姣姣

(天津中德职业技术学院, 天津 300350)

目前对甜菊糖的研究很多，而且制备甜菊糖的过程复杂，既浪费能源又污染环境，本实验目的是制备一种粗制品绿色甜菊糖，以备后续制备复合甜味剂。采用比较简单传统的提取制备工艺，研究了提取温度、提取时间、料液比对甜菊糖提取率的影响，通过单因素实验确定提取甜菊糖的最优工艺：提取温度70℃，时间1h，料液比为20 ml/g，在此条件下甜菊糖苷的提取率可达到88%且保持较好的品质；功能成分分析结果：甜菊糖苷的含量为60.86%；最大吸收峰为370nm，比吸光度E=4.458；经过液相色谱分析SS%为12.49%、RA%为10.46%、RC%为2.79%、DA%为1.55%。

甜菊糖；制备；成分；测定

甜菊糖是一种热量低、甜度高的天然型甜味剂，市面上应用范围很广，在饮料、糕点、啤酒、膨化食品等方面都有，是除了甘蔗、甜菜糖之外，第三种有开发价值的甜味剂就是甜菊糖这种天然可替代蔗糖的甜味剂了[1]。

甜菊糖的最大特点就是甜度高，甜味与木糖醇相似，甜菊糖虽然甜度高，但是其溶液具有明显的苦涩后味，而且随着甜菊糖溶液浓度的升高，苦涩后味越来越显著[2]。国内外的研究中主要从优化生产工艺、酶法修饰[3]、环状糊精包埋法等方式去除甜菊糖不良后苦味[4]。

1 材料和方法

1.1 实验材料

1.1.1 原料

甜菊叶。

1.1.2 实验试剂和主要仪器设备

试剂：蔗糖、氢氧化钠、盐酸、氢氧化钠、牛血清白蛋白、无水葡萄糖、磷酸、碳酸钙、蒽酮、苯酚、硅藻土、海藻酸钠、甲醛。

主要仪器设备：PHS-3C型、pH计、G10型医用高速离心机、DZF-6020真空干燥箱、LHS-150SC恒温恒湿箱、SP-2102UV型紫外可见分光光度计、FJ-200高速分散均质机、冷冻干燥机、循环水真空泵、4000 MS气相色谱-质谱联用仪、全波长扫描紫外分光光度计、ESJ205-4型电子天平、TG328A分析天平、HYG-IIa 回转式恒温调速摇瓶柜、K9840自动凯氏定氮仪。

1.2 实验方法

1.2.1 绿色甜菊糖的制备

采用乙醇法一步提取甜菊糖，与传统的提取精致甜菊糖苷的方法相比既可以减少提取过程中添加的有毒有害物质[5]，还可以减轻经济与环保压力，而且甜菊糖糖的粗提物中还会包含一些对人体有益的维生素、叶绿素等。据文献报道，传统的提取方法主要采用70%的乙醇80℃水浴加热的方法，本实验选择磁力搅拌水浴加热的方法，分析料液比、水浴加热温度、提取时间对甜菊糖提取率的影响。

1.2.1.1 甜菊糖苷的测定

提取液中的甜菊糖苷的测定方法参考GB8270-1999中容量法。

甜菊糖苷的提取率可用下式计算：

1.2.1.2 水浴加热温度对甜菊糖苷提取率的影响

在电子天平上称取6份10g经过粉碎的新鲜甜菊叶分别放入250ml的锥形瓶中，倒入150ml浓度为70%的乙醇，放入磁力搅拌水浴锅中，水浴温度分别为50℃、60℃、70℃、80℃、90℃、100℃，1h之后将残渣倒出，测定甜菊糖苷的含量，计算提取率。

1.2.1.3 料液比对甜菊糖苷提取率的影响

称取6份10g粉碎后的甜菊叶分别放入合适的烧杯中，分别倒入100ml、150ml、200ml、250ml、300ml、350ml的浓度为70%的乙醇，放入磁力搅拌水浴锅中，水浴温度为80℃，1h之后将残渣倒出，测定甜菊糖苷的含量，计算提取率。

1.2.1.4 提取时间对甜菊糖苷提取率的影响

称取6份10g粉碎后的甜菊叶分别放入250ml的烧杯中，倒入150ml浓度为70%的乙醇，放入磁力搅拌水浴锅中，水浴温度为80℃，分别于30min、60min、90min、120min、150min、180min之后将残渣倒出，测定甜菊糖苷的含量，计算提取率。

1.2.2 绿色甜菊糖的分析

1.2.2.1 绿色甜菊糖中功能成分的分析

(1)总苷含量的测定

葡萄糖标准溶液的配制。精密称取干燥至恒重的葡萄糖标准品1.2g，置于100mL容量瓶中，乙醇定容至刻度，配成12mg/mL的储备液。

蒽酮溶液的配制。称取0.1g蒽酮溶于50ml浓度为70%的硫酸中，配制2mg/ml的硫酸蒽酮溶液。

标准曲线的绘制。分别吸取0.1ml、0.2ml、0.3ml、0.4ml、0.5ml、0.6ml的葡萄糖标准溶液，各以乙醇补至1.0mL，然后加入2mg/ml的硫酸蒽酮溶液5.0mL，充分摇匀，沸水加热10 min以后于445nm测光密度，乙醇作为空白对照。横坐标为葡萄糖浓度(mg/mL)，纵坐标为光密度，得到标准曲线如图1。

测定样品。取一定量的测试样品0.1g～0.5g，其他操作同上，使其测定值在标准曲线的直线范围内，根据标准曲线求得相应葡萄糖含量，计算样品中总苷含量。计算公式：

(2)比吸光度的测定

精确称取样品1.0g于烧杯中，加少量水溶解。移入50mL容量瓶中稀释至刻度。

用全波长扫描紫外分光光度计于200nm～800nm范围进行全波长扫描，确定最大吸收峰。用分光光度计在最大吸收波长下测定比吸光度。比吸光度计算公式：

式中： H— 液层高度，单位：cm;

a—测得的吸光度;

c— 每100ml溶液中含有样品的质量，单位：g。

(3)薄层色谱法定性分析主要成分

称取5mg绿色甜菊糖粉末导入的安道管中，然后精确加入1ml浓度为70%乙醇，充分溶解以备分析使用。分别配制标品甜菊糖苷(SS)、莱鲍迪苷A(RA)，浓度为1‰。

高效薄层硅胶铝板长宽为1cm×2cm，展开剂为氯仿：甲醇：水=3：1.5：0.4，点样点距离底板约有1.5cm，点样斑点直径应小于3mm，待展开剂前沿距板顶2cm时，立即取出，自然晾干，用5%的硫酸均匀喷至板上，置于120-110℃的烘箱内加热8min～10min，使其显色。

(4)高效液相色谱定量分析主要成分

标准溶液的制备。将标准样品甜菊糖苷(ss)置于105℃干燥箱中，烘2h，分别称取120mg，90mg，60mg，30mg4份样品，均用80：20的乙腈/水溶液溶解，并稀释至25ml[6]。

样品溶液的配制。称取经105℃干燥2h的样品120mg，用80：20的乙腈/水溶液溶解，并稀释至25ml,摇匀。

液相色谱仪的条件。色谱柱为-NH2基柱，流动相为乙腈：水=80：20，流速为1.2ml/min,检测器为紫外检测器，波长210nm，进样量为15ul。

首先测定四个甜菊糖苷标准溶液，并绘制标准曲线(峰面积A-浓度C曲线)，测定甜菊糖苷样品液，记录莱鲍迪苷A(RA)、莱鲍迪苷C(RC)、甜菊糖苷(SS)、杜克苷A(DA)和甜菊双糖苷的面积Aa、Ac、As、Ad、Ab。将Aa、Ac、As、Ad、Ab分别乘以1.20、1.18、1.00、0.98和0.80得到A′a、A′c、A′s、A′d、A′b。以标准曲线的斜率k=A/C分别计算出上述五个组分的含量Pi(%)。计算公式：

式 中: i —— a,c,s,d,b;

m —— 样品的质量，单位：g。

2.结果与讨论

2.1 甜菊糖苷最适提取温度的确定

如图2所示，在提取为温度为40℃～80℃范围内随着水浴温度逐渐升高，甜菊糖的提取率跟着升高，当温度接近70℃左右时甜菊糖提取率基本不再变化，而且70℃之后随着加热温度的升高甜菊糖的提取率也不再有较大变化[7]。使用磁力搅拌水浴加热的方法最适提取温度比采用普通的水浴加热方法的最适提取温度低10℃左右，这是因为使用磁力搅拌的方法使甜菊叶与提取液可以更加充分的接触，通过增大与溶液的接触面积，利于甜菊糖苷的提取，同时从节约能源考虑，最适温度选取70℃。

2. 2 甜菊糖苷最适提取时间的确定

如图3所示，对甜菊糖苷的提取时间较短时，为30min左右，提取率较低，当提取时间增加一倍达到1h左右时，提取率有较大的提高。1h之后随着时间的延长，提取率虽然有小幅升高，但是提取液的气味有一种苦味，而且随着提取时间的延长提取液中的杂质含量也在升高，综上所述，甜菊糖苷的最适提取时间选为1h。

2.3 甜菊糖苷最适料液比的确定

如图4所示，随着料液比的增加，甜菊糖苷的提取率呈现上升趋势，当料液比达到20(ml/g)时,甜菊糖苷的提取率达到78%，且溶液中杂质相对较少，随着料液比的增加浸提液中杂质量略有增加，但是幅度较小，但提取液过多既增加生产成本而且不利于后续的冷冻干燥，所以本实验选择料液比为20(ml/g)。

2.4 甜菊糖苷最优条件的确定

综上所述，甜菊糖苷的最优提取条件为：提取温度70℃，提取时间1h，料液比为20(ml/g)，在此条件下甜菊糖苷的提取率可达到88%且保持较好的品质。

2.5 绿色甜菊糖功能成分分析结果

(1)甜菊糖总苷量的确定

以445nm为最大吸收波长，在紫外分光光度下，测定甜菊糖在酸性葱酮中的吸光度，乘上一个校正系数后, 则可以测定出甜菊糖苷的含量为60.86%。

(2)甜菊糖比吸光度的确定

甜菊糖经过全波长扫描后，该绿色甜菊糖粉末在370nm下有最大吸收峰，如图5所示。测得比吸光度E=4.458。

(3)绿色甜菊糖中主要成分定性分析结果

甜菊糖中主要成分是Stevioside(SS) 和Rebaudioside A(RA)，如图6所示，可通过薄层色谱法定性鉴定出这两种物质。

(4)绿色甜菊糖中各类糖味成分的含量

本实验采用NH2柱，乙腈:水=80:20为流动相，线性关系良好的质量浓度在1mg/ml～10 mg/ml 时，采用紫外检测器，分析主要成分含量。SS为标品所制作的工作曲线如图7所示，甜菊糖样品色谱图如图8所示，测得SS%=12.49%、RA%=10.46%、RC%=2.79%、DA%=1.55% 。

3.结论

(1)甜菊糖的最佳提取工艺的确定

通过单因素试验确定了甜菊糖的最佳提取工艺为：提取温度70℃，时间1h，料液比为20 ml/g，在此条件下甜菊糖苷的提取率可达到88%且保持较好的品质。

(2)甜菊糖的成分分析的结果

① 基本成分分析结果：粗灰分为5.51%，水分为8.2%，粗纤维为9.8%，叶绿素a为1.144g/mg，叶绿素b为0.4427g/mg。

② 功能成分分析结果：甜菊糖苷的含量为60.86%；最大吸收峰为370nm，比吸光度E=4.458；经过液相色谱分析SS%为12.49%、RA%为10.46%、RC%为2.79%、DA%为1.55%

[1] 杨远志，李发财.甜菊糖的应用现状及发展前景[J].发酵科技通讯，2011，30(1):40～41

[2] 郭雪霞，赵仁邦. 甜菊糖苷的保健功能及其在食品中的应用[J]. 中国食物与营养,2012， 18( 1): 32～35

[3] 史作清，朱伯儒.葡萄糖基-甜菊糖的酶促合成反映研究[J]. 高等学校化学报,1996，11(2):1800～1803

[4] 王贵民,董振红,郝再彬.甜叶菊糖苷的应用和安全性的研究进展[J].中国食品添加剂,2007,21(6):65～69

[5] 赵永金，孙传庆. 从甜叶菊中提取甜菊苷的工艺研究[J].西北农业大学学报，1994,27(2):80～82

[6] 赵永良，崔媛.高效液相色谱法测定甜菊糖苷中莱鲍迪苷A[J].食品科技,2009,34(9):293～294

[7] 舒世珍. 甜菊开发的进展与展望[J].农牧情报研究,1989,(3):17～24

[责任编校：张彩红]

2015-11-15

王姣姣，女，天津人，中德职业技术学院助教。

TS201.56

A

1009-5462(2016)01-0060-06