粉尘螨13.8 kDa溶菌酶的克隆表达、纯化鉴定及生物信息学分析

梁志林，刘志刚，邬玉兰，陈思敏，杨平常，刘晓宇



粉尘螨13.8 kDa溶菌酶的克隆表达、纯化鉴定及生物信息学分析

梁志林，刘志刚，邬玉兰，陈思敏，杨平常，刘晓宇

目的克隆表达粉尘螨13.8 kDa 溶菌酶(Bac)基因, 纯化鉴定蛋白的过敏原性, 并进行生物信息学分析。方法

粉尘螨；13.8 kDa 溶菌酶(Bac)；原核表达；免疫原性鉴定；生物信息学分析

在已知的数十种尘螨中,与人类过敏性疾病关系最密切的主要有屋尘螨(Dermatophagoidespteronyssinus, Der p)和粉尘螨(Dermatophagoidesfarinae, Der f)，可诱发I型变态反应, 从而引起哮喘、过敏性鼻炎、异位性皮炎和荨麻疹等多种过敏性疾病[1-2],是最重要的过敏原[3]。目前, 利用尘螨的主要过敏原来检测尘螨过敏和进行免疫治疗是非常重要的手段。我国学者首次对粉尘螨基因组学和转录组学进行研究，并对Der f1-24进行报道[4-5]，极大地丰富了尘螨过敏原基础研究。本文利用基因工程技术克隆粉尘螨Bac基因，并利用pET-44a原核表达系统进行表达及分析，获得具有IgE结合活性的重组过敏原13.8 kDa 溶菌酶(Bac)，并对免疫学特性进行鉴定；同时，用生物信息学方法对其结构和功能进行分析，为进一步研究粉尘螨Bac过敏原的结构和功能提供理论依据。

1　材料和方法

1.1主要试剂和材料

1.1.1菌株和动物粉尘螨(Der f)由深圳大学过敏反应与免疫学研究所标准化纯培养并提供，大肠杆菌E.coliTop10F’和E.coliBL21 (DE3) 为本实验室保存。

1.1.2质粒和试剂原核表达载体p ET-44a为本研究室保存。限制性内切酶EcoR I和XhoI、T4 连接酶、AMV 反转录酶、Taq DNA 聚合酶等购自Ta KaRa 公司。高保真Pfu DNA 聚合酶购自Fermentas公司。RNA提取试剂盒、DNA 片段纯化试剂盒购自Qiagen 公司。Ni2N TA resin及柱子购自Amer sham Pharmacia公司。

1.1.3血清取自广州医科大学第一附属医院变态反应科，临床上选择经粉尘螨皮试阳性的过敏性哮喘和过敏性鼻炎患者18例和粉尘螨皮试阴性的健康人10例。分别采集静脉血各5 mL，经37 ℃静置4 h，然后5 000 × g离心5 min 收集上层血清,再选用法玛西亚CAP 过敏原自动监测系统,收集粉尘螨特异性IgE阳性且反应达3 级或3 级以上的患者血清10 例进行混合,作为阳性血清; 另取10 例粉尘螨特异性IgE 阴性的健康人血清10 例进行混合,作为阴性血清,二者分装后-80 ℃低温保存备用。

1.2方法

1.2.1RT-PCR扩增及其产物的克隆以提取的总RNA为模板，逆转录cDNA，进行PCR 扩增反应。反应体系如下(50 μL)：10 × Ex Taq Buffer 5 μL；TaKaRa ExTaq 0.25 μL；dNTP Mixture，4 μL；上下游引物各2 μL，cDNA 为模板1 μL；加去离子水至50 μL。 PCR反应条件：94 ℃变性1 min；50 ℃退火1 min；72 ℃延伸1 min；35 个循环，PCR 产物经1% 琼脂糖电泳验证并拍照。将上述PCR 产物与pMD-18T 连接后，热转化至E.coliTop10 中，涂布于含氨卞霉素( 100 mg/L)的LB 平板上，37 ℃培养过夜，从LB 平板上挑选白色菌落放入含氨卞霉素的LB 培养液中扩大培养，提取质粒。 用BamHI酶切鉴定，重组质粒，委托华大基因工程(深圳)有限公司进行序列。

1.2.2Bac蛋白的诱导表达将上述鉴定的pET44a-Bac转化至感受态大肠杆菌BL21 ( DE3)，待细菌生长处于对数生长期( A600nm=0.6～0.9) 时, 加入20 μL 1 mol/L的IPTG, 诱导蛋白表达。诱导4 h后取1 mL 菌液，离心弃上清液, 加100 μL去离子水后重悬菌体，加20～25 μL 10×SDS-PAGE 上样缓冲液混合, 沸水浴10 min，按照5 μL，10 μL，20 μL上样，进行SDS-PAGE 电泳分析, 以检测重组蛋白表达情况。诱导表达的重组蛋白，经裂解、溶菌、超声，将上清液以2 mL/min 的速度上样于已平衡好的Ni-NTA 柱。然后用平衡液充分洗柱，再分别用含40、300 mmol/L 咪唑平衡缓冲液进行洗脱，收集各次洗脱液进行SDS-PAGE 分析。

1.2.3重组Bac蛋白的过敏原性鉴定将重组Bac蛋白以不同的浓度梯度包被微孔板，以对粉尘螨过敏的患者的血清作为一抗、以HRP抗人IgE为二抗建立了间接ELISA法进行特异性检测分析。

1.2.4重组Bac蛋白的生物信息学分析

1.2.4.1测定Bac的基因序列以及Bac基因的同源性分析基因序列的测定送由深圳市华大基因有限公司进行完成，Bac基因的同源性分析用NCBI 网站在线软件分析其ORF，用Translate Tool 推导其氨基酸序列，用clustalw2进行同源性分析。在NCBI数据库，BLAST比对出与Bac蛋白序列相关性最强的10个蛋白质序列，用MEGA5 工具包来构建系统进化树。

1.2.4.2Bac蛋白的理化性质用PmtParam对尘螨Bac蛋白的理化性质进行预测。

1.2.4.3Bac的蛋白质结构及T细胞、B细胞表位预测用PSIPRED预测其二级结构,用SWISS-MODEL预测其三级结构；选取与人类哮喘相关的等位基因，利用网络服务器 IEDB内相关软件、Preprod在线预测工具对Bac蛋白T细胞抗原表位进行预测；采用DNAStar软件提供的Protean模块对Bac的B细胞抗原表位进行预测。

2　结　果

2.1RT-PCR 扩增Bac片段，表达载体pET44a-Bac 的构建以纯培养的活粉尘螨提取的总RNA为模板，进行设计的特异性引物为上下游引物，再以反转录所得到的cDNA为模板扩增得到约为400 bp的片段，大小与预期相符(图1)。将Bac目的基因经EcoRI和XhoI双酶切并克隆到pET-44a表达载体上得到重组质粒pET44a-Bac。

M: DNA相对分子质量标准；1:扩增的Bac基因M: DNA marker; 1: PCR prouct from Bac.图1　目的基因的RT-PCR产物Fig.1　PCR product of ferritin from Bac

2.2重组蛋白的表达和纯化含有pET44a-Bac的表达菌株经终浓度为1 mmol/L的IPTG诱导4 h，表达蛋白进行SDS-PAGE 电泳,考马斯亮蓝染色, 结果显示阳性克隆菌株在相对分子质量(Mr) 约14 kD处有外源蛋白表达的条带出现, 其Mr与预计值相符(图2)。

M: Protein Marker；1:纯化的重组Bac蛋白M: Protein marker；1: Purification protein.图2　重组Bac蛋白在大肠杆菌中的诱导表达Fig.2　SDS-PAGE of protein which had been purified

2.3重组Bac蛋白ELISA免疫原性鉴定选用粉尘螨过敏患者阳性血清作为一抗，以HRP抗人IgE为二抗，采用间接ELISA方法进行检测，鉴定结果显示重组Bac与尘螨过敏患者阳性血清的IgE特异性结合活性明显高于正常对照者血清的IgE结合活性(t=43.970,P<0.01)(图3)。

A：粉尘螨过敏患者阳性血清；B：正常对照组血清A: Positive serum; B: Normal serum.图3　Bac蛋白ELISA免疫原性鉴定结果Fig.3　Immunogenicity appraisal result of ELSIA

2.4粉尘螨Bac蛋白生物信息学分析

2.4.1测定Bac的基因序列以及Bac基因的同源性分析测得的13.8 kDa溶菌酶(Bac)的基因序列为“atggatggttcacatattgtaaaggcagcacgatcacaaattgg tgtaccatattcatggggtggtggtggtattcatggtaaatccaaaggta ttggtgaaggtgcaaatatcgttggatttgattgttctggattggcacaa

tattccatttatcagggaacacataaaacaattgctcgtacagctgcagc

acaatataatgataaccattgtcatcatgttgcatacggtagtcatcaacc aggtgatctggtatttttcggtaatccaatctatcatgttggtattgtatc

ggcacatggtcgtatggtcaatgcacctaaacccggtactaaagttcgt gaagaaaatatttggagttatcatatttctcatgttgctcgatgttggtaa”。将推导出的Bac蛋白的氨基酸序列输入NCBI网站进行Blast比对分析，同源序列以Fasta格式输出后用MEGA5．1软件构建分子进化树(图4)，结果显示粉尘螨与屋尘螨(Dermatophagoidespteronyssinus，gi|540198595|、gb|AGV05390.1|、gi|22595340|、gb|AAN02509.1|AF409109)亲缘关系比较近；同时，Bac蛋白在链霉菌属(Streptomyces，gi|917111437|ref|WP 051718149.1|)、南海海洋所菌属(Sciscionella，gi|521987581|ref|WP 020498852.1|)、绿僵菌属(Metarhizium，gi|743660388|、gb|KID87636.1|、gi|734664381|、gb|KHO01427.1|)、弯颈霉菌属(Tolypocladium，gi|908391921|、gb|KND92543.1|)、球孢白僵菌(Beauveriabassiana，gi|667658361|ref|XP 008601012.1|、gi|400595504|、gb|EJP63299.1|)和蛹虫草(Cordycepsmilitaris，gi|573987537|ref|XP 006671689.1|)中有类似的表达。

图4　Bac的系统进化树分析Fig.4　Phylogenetic relationship of Bac

2.4.2Bac的理化性质用PmtParam对尘螨Bac蛋白的理化性质进行预测，推测该蛋白的分子式为C627H944N188O178S5，原子总数为1 942，分子质量是 14 123.8，理伦等电点9.08；该蛋白含Gly (G) 最多，占14.5%；负电荷氨基酸残基数为7，正电荷氨基酸残基数为11，总的平均疏水性为0,320，脂肪指数为70.00，不稳定指数是31.63，按ProtParam定义，不稳定系数分值小于40时，预测蛋白较稳定，故Bac蛋白的性质稳定。

图5　Bac二、三级结构及T细胞、B细胞表位预测图

2.4.3Bac的蛋白质结构及T细胞、B细胞表位预测将Bac的氨基酸序列输入到蛋白质结构预测服务器中(PSIPRED)，对其进行二级结构的预测(图5A)。用同源模建法，提交序列到SWISS-MODEL服务器进行自动模建，得到其三维结构。其结果与所选取X-衍射得到的模板序列相似性为40.32%(图5B)。二级结构与三级结构预测都表明Bac主要由无规则卷曲构成。用 网 络 服 务 器 IEDB 数 据 库、 Preprod对 Bac蛋白 T细胞抗原表位预测得到 4个肽序列(6-14、38-46、85-99和122-130)。利用DNAStar软件预测Bac的B细胞表位。蛋白质的亲水性、表面可及性、柔韧性等在抗原的形成方面发挥着重要的作用,当亲水性>0，抗原指数>0，表面可及性>l时，形成表位的可能性大，综合其上各参数可推导出该蛋白的抗原区分别为氨基酸的15-30、 26-40、44-59、58-73、95-110和101-116(图5为Bac蛋白质二三级结构预测图，T细胞、B细胞表位见图5。

3　讨　论

尘螨普遍存在于人类居住环境中，可引起人体许多过敏反应如过敏性哮喘、过敏性鼻炎等[1]，尘螨是导致过敏性疾病最重要的吸入性变应原(过敏原)，约有70%～80%的哮喘患者对尘螨过敏[2]。屋尘螨(Der p)和粉尘螨(Der f)是我国室内最主要的两种优势螨种，目前研究发现尘螨含有Der 1-24种过敏原，其中Der f2和Der p2对过敏性疾病(哮喘)患者免疫诊断阳性率最高[3-4]。Der p2对过敏性疾病(哮喘)患者免疫诊断阳性率为87.8%[6]。近50年来，国内外有关学者在对当地尘螨进行众多的种类调查、抗原分析纯化等工作的基础上，制备出粉尘螨过敏原浸液用于临床特异性诊断和免疫治疗(脱敏治疗)，并取得了较好的疗效[7]。尘螨疫苗特异性免疫治疗是WHO认可的目前治疗尘螨过敏性哮喘唯一的对因治疗方法，其主要机制包括调节机体抗原提呈细胞、T细胞和B细胞反应，转换相关抗体亚型，抑制过敏性炎症效应细胞(如嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞和肥大细胞)等[9-10]；即主要通过调节机体特异性免疫应答来发挥对因治疗作用[11]。故对尘螨过敏原的深入研究将有助于尘螨过敏诊断和免疫治疗。

粉尘螨溶菌酶(Bac)属于N-乙酰胞壁质聚糖水解酶家族，Childs M和Erban T等研究发现，尘螨可利用其溶菌酶消化芽孢杆菌，作为自身的食物来吸取养分[10-11]。本研究克隆粉尘螨Bac的DNA基因序列全长为396 bp，可编码131个氨基酸。分子进化遗传分析(molecular evolutionary geneticsanalysis，MEGA)工具包结果显示粉尘螨与屋尘螨的亲缘关系最近，粉尘螨Bac基因与屋尘螨中的LytFM基因(gb|KF113885.1|)同源性高达96%。利用间接ELISA法，证实粉尘螨Bac蛋白与尘螨过敏患者血清IgE具有特异性结合的能力。

生物信息学(Bioinformatics)是研究生物信息的采集、处理、存储、传播，分析和解释等各方面的学科，是通过基因序列可预测其相应蛋白质结构和功能的重要工具[12]。本文通过运用生物信息学方法对粉尘螨Bac的理化性质、蛋白结构及T细胞、B细胞表位进行预测。结果显示Bac蛋白含Gly (G) 最多，占14.5%，蛋白较稳定。二级结构与三级结构预测都表明Bac要由无规则卷曲构成。抗原表位是抗原分子中决定抗原特异性的特殊化学基团，包括B细胞表位和T细胞表位。T细胞表位为可被 T细胞表面受体或抗体特异性识别并相互结合的片段，重叠肽法或酸洗脱法是传统的确定T细胞表位的方法，但这两种方法耗费毕竟大。利用生物信息学技术进行 T细胞表位预测能大幅度提高工作效率，可以有效节约研究成本，本文用网络服务器IEDB数据库、Preprod对粉尘螨Bac蛋白的T细胞抗原表位预测得到4个肽序列；可被B细胞表面受体或抗体特异性识别并相互结合的片段为B细胞表位；利用DNAStar软件进行Bac蛋白的B细胞表位预测得到6个肽序列。本研究为进一步研究粉尘螨过敏原的结构和功能提供理论依据。

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Cloning and expressing theDermatophagoidesfarinae13.8 kDa lysozyme (Bac) gene, purifying and identifying the protein allergenicity and analysis of the Bac protein

LIANG Zhi-lin, LIU Zhi-gang, WU Yu-lan, CHEN Si-min, YANG Ping-chang, LIU Xiao-yu

(InstituteofAllergyandImmunology,ShenzhenUniversity,Shenzhen518060,China)

The aim for this study is cloning and expressing theDermatophagoidesfarinae13.8 kDa lysozyme (Bac) gene, purifying and identifying the protein allergenicity and conducting bioinformatics analysis of the Bac protein. Total RNA was extracted from cultured dust mites. The primers designed according to sequences was amplified by RT-PCR. The PCR product was cloned into pMD32-T vector, and then subcloned into pET-44a vector by restriction endonucleaseEcoR I andXhoI. The recombinant plasmid pET44a-Bac was transformed intoE.coliBL21 and was induced with IPTG. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) technique was used to test the allergen of Bac and the clustalw2 was used to conducted homology analysis and MEGA5 to construct phylogenetic tree of Bac. ProtParam tools were used to predict its physical and chemical properties. PSIPRED and SWISS-MODEL were used to predict its secondary structure and tertiary structure. IEDB and Preprod was used to analyze the T cell antigen epitope. DNAStar was used to analyze the B cell antigen epitope of Bac. After sequencing, we have successfully cloned the Bac gene, and the open reading frame was 396 bp, encoding 131 amino acid group.The Bac gene was transferred intoE.coliBL21 (DE3). After induction with IPTG, Bac protein was largely expressed. The protein mainly existed in soluble form; protein molecular weight was about 14 kDa. The indirect ELISA method results showed that Bac could bind with dust mite allergic patients serum IgE. Comparing the clonedDerfBac amino acid sequence with other mites, we found that its homology with NCBI accession number KF113885.1 was 96%. The molecular evolutionary tree analysis showed that Bac had a close relationship withDermatophagoidespteronyssinus. The physical and chemical properties prediction showed Bac protein was stable. The prediction of the secondary and tertiary structure indicated that Bac mainly consisted of random coil. Bioinformatics analysis predicted four peptides (6-14, 38-46, 85-99, 122-130) as the T cell epitopes and six peptides (15-30, 26-40, 44-59, 58-73, 95-110, 101-116) as the B cell epitopes. We have successfully cloned and expressed the Bac, and confirmed that the recombinant Bac protein has good immunogenicity. The study provides a basis for further study of composition and physicochemical properties of house dust mite allergen.

Dermatophagoidesfarina; 13.8 kDa lysozyme (Bac); expression; immune identification; bioinformatics

Liu Xiao-yu, Email: lxy0901@163.com

10.3969/j.issn.1002-2694.2016.09.003

刘晓宇，Email：lxy0901@163.com

深圳大学过敏反应和免疫学研究所，深圳 518060

R392.8

A

1002-2694(2016)09-0779-05

2015-10-31;

2016-02-06

国家自然科学基金(No.91442118、No.31400786)、广东省科技计划社会发展项目(No.2013B03180002)、广东省对外科技合作项目(No.2013B051000088)、广东省公益研究与能力建设专项资金(No.2013B031800023)、深圳市科技计划国际科技合作项目(No.GJHZ20130408174112021)和深圳市科技计划基础研究项目(No.JCYJ20140828163633992)联合资助

挑取经纯培养的粉尘螨，提取总RNA，根据已知基因序列设计引物，经RT-PCR扩增Bac基因片段，产物连入pMD-32T载体中。扩增后，利用限制性内切酶EcoRI和XhoI双酶切将目的基因片段连接到Pet-44a表达载体上，转化到大肠杆菌BL21( DE3)中经IPTG诱导表达；间接ELISA法检验重组Bac蛋白特异性过敏原性；clustalw2进行同源性分析，MEGA5工具包来构建系统进化树，ProtParam Tools 预测其理化性质，PSIPRED预测其二级结构，SWISS-MODEL预测其三级结构。利用网络服务器 IEDB内相关软件和Preprod，对Bac蛋白T细胞抗原表位进行预测。用DNAStar对Bac的B细胞抗原表位进行预测。结果经测序鉴定，本研究成功克隆出了粉尘螨Bac基因，其开放阅读框396 bp，编码131组氨基酸。将Bac基因导入大肠杆菌E.coliBL21 (DE3)，经IPTG诱导后高效表达Bac重组蛋白。该蛋白主要以可溶性形式存在，蛋白分子量约14 kDa。间接ELISA法证明Bac能与粉尘螨过敏患者血清IgE结合。测序发现本实验室克隆的粉尘螨Bac基因与GenBank上公布的GenBank KF113885.1同源性为96%。系统进化树结果显示粉尘螨与屋尘螨亲缘关系比较近。理化性质预测显示Bac蛋白质较稳定。二级结构及三级结构预测结果显示Bac的结构主要以无规则卷曲组成。T细胞抗原表位预测得到 4个肽序列(6-14、38-46、85-99、122-130)。B细胞抗原表位预测得到6个肽序列(15-30、26-40、44-59、58-73、95-110、101-116)。结论成功克隆并表达了粉尘螨Bac，并证实重组Bac蛋白具有良好的免疫原性，为进一步研究尘螨过敏原的结构成分及其理化性质奠定理论基础。

Supported by the Natural Science Foundation of China (Nos. 91442118 & 31400786), the Science and Technology Social Development Project Plan of Guangdong Province (No. 2013B03180002), the Science and Technology Cooperation Project of Guangdong Province (No. 2013B051000088), the Public Welfare Research and Capacity Construction in Guangdong Province Special Funds (No. 2013B031800023), the Science and Technology Plan of International Technology Cooperation Projects of Shenzhen (No. GJHZ20130408174112021), the Science and Technology Plan of Basic Research Project of Shenzhen (No. JCYJ20140828163633992)