急性冠脉综合征患者基因分型对血小板聚集率影响的研究

吕　磊　谭文亮　吴天源　孙少喜

广州市第一人民医院心内科(广州 510180)

Lv Lei, Tan Wenliang, Wu Tianyuan, et al.

Guangzhou First People’s Hospital, Guangzhou 510180, China



急性冠脉综合征患者基因分型对血小板聚集率影响的研究

吕磊谭文亮吴天源孙少喜

广州市第一人民医院心内科(广州 510180)

目的探讨CYP2C19不同基因分型对急性冠状动脉综合征(ACS)患者服用氯吡格雷后血小板聚集率的影响。方法选取2015年1月—2016年3月入住心内科的ACS患者258例为研究对象。入院时及服用氯吡格雷三日后分别抽取静脉血检测血小板聚集率及CYP2C19基因型。 结果快代谢型组(extensive metabolisers, EM)和中代谢型组(intermediate metabolisers, IM)服药前后血小板最大聚集率分别为(58.76±15.45)% vs(35.17±10.26)%和(59.35±11.58)% vs(47.66±12.59)%(P<0.05), 而慢代谢型组(poor metabolisers, PM)的血小板最大聚集率无明显降低。快代谢型组的最大血小板聚集率的降低幅度比慢代谢型组大(23.58±12.39% vs 11.65±13.56%,P<0.05)。 共有33例(12.79%)患者为氯吡格雷抵抗, 其中快代谢型组中氯吡格雷抵抗者2例(1.67%), 中代谢型组中氯吡格雷抵抗者3例(2.80%), 慢代谢型组中氯吡格雷抵抗者28例(90.32%) (三组比较P=0.038)。 结论ACS患者CYP2C19基因分型与服用氯吡格雷后血小板最大聚集率有关，与氯吡格雷抵抗有关。

血小板聚集率基因分型CYP2C19急性冠脉综合征

LvLei,TanWenliang,WuTianyuan,etal.

GuangzhouFirstPeople’sHospital,Guangzhou510180,China

双联抗血小板治疗(阿司匹林联合氯吡格雷)是临床上治疗急性冠状动脉综合征(ACS)的基本方法。然而，部分患者尽管已经接受规范的双联抗血小板治疗，但仍会出现反复的缺血事件[1-3]。氯吡格雷低反应性是导致患者抗血小板治疗无效或效果不良的重要原因之一，其发生机制至今尚未完全明确，可能与基因多态性、药物间相互作用、患者的依从性、糖耐量异常以及肥胖等因素相关[4-7]。本研究分析ACS患者CYP2C19 基因型与服用氯吡格雷后血小板聚集率变化的关系，为ACS患者的抗血小板治疗提供一定依据。

1　资料与方法

1.1一般资料入选2015 年1月—2016 年3月入住心内科的ACS患者258例为研究对象。其中男135 例，女123例; 年龄38～85 岁，平均( 63.7±8.5) 岁; ACS诊断标准①符合2007 年美国心脏学会/美国心脏学会指南[8-9]。排除标准： ①血常规中血小板计数>300×109/L 或<100×109/ L； ②肝功能异常[丙氨酸转氨酶(alanine aminotransferase， ALT)和天冬氨酸氨基转移酶(aspartate transaminase， AST)>正常值的3倍及以上]；③严重肾功能不全[血清肌酐>442 μmol/L或估测肾小球滤过率(estimated glomerular filtration rate， eGFR)<30 mL / (min·1.73 m2)]以及维持性血液透析患者；④有明确的活动性出血或出血高风险患者；⑤恶性肿瘤、自身免疫性疾病及各种急慢性血液病者。

1.2入院当天及服用氯吡格雷三日后分别抽取静脉血检测患者血小板聚集率。服药前血小板聚集率基线水平与服药后最大血小板聚集率的差值不大于10%的患者，定义为氯吡格雷抵抗。

1.3实验室检测方法

1.3.1血小板聚集率用枸橼酸抗凝管采外周静脉血3～5 mL，用比浊法进行血小板功能检测，仪器采用Chrono-Log Lume-Aggregometer (model 700，美国)。

1.3.2基因位点检测用EDTA(乙二胺四乙酸)抗凝管采外周静脉血2～3 mL，采用基因芯片杂交技术(即基因微阵列)法检测。取200 μl血，用DNA纯化试剂盒(上海百傲科技股份有限公司，BST01051)提取全基因组DNA，测定DNA浓度并作为PCR(Polymerase Chain Reaction，聚合酶链式反应)模板。根据 NCBI 上 CYP2 C19*2和CYP2C19*3的上下游序列信息，设计2对引物和一个质控寡核苷酸。CYP2C19*2：5′Biotin-CTTGGCATATTGTATCTATACCTTT 3′和3′TAAACATCCGTAGTAAACACAAAAC 5′；CYP2C19*3：5′Biotin-CACCCTGTGATCCCACTTTC 3′和3′TATTCACCCCATGGCTGTCT 5′；质控寡核苷酸：5′Biotin- ACATCCTCTAAATGATGTGAGACCATGCGGAGCCCCTCCACG 3′。按照CYP2C19基因检测试剂盒(DNA微阵列芯片法)使用说明书加样后，在Bioer TC-96/G/H(b)PCR仪(杭州博日科技有限公司)进行扩增。扩增产物使用全自动杂交仪(上海百傲科技股份有限公司，BR-526)与生物芯片识读仪(上海百傲科技股份有限公司，BE-2.0)进行杂交显色与结果分析。

2　结　果

2.1基因型构成及分组根据基因型构成，将患者分为快代谢型(携带CYP2C19*1/*1等位基因)120例(46.5%)；中代谢型107例(41.5%)，包括携带CYP2C19*1/*2等位基因94例和携带CYP2C19*1/*3等位基因13例；慢代谢型31例(12.0%)，包括携带CYP2C19*2/*2等位基因21例、携带CYP2C19*2/*3等位基因9例和携带CYP2C19*3/*3等位基因1例。

2.2不同基因型组间血小板抑制率的比较(见表1)

表1　不同基因型组间血小板抑制率的比较

注：#表示2组比较P=0.346

2.3不同基因型组间氯吡格雷抵抗的比较258例患者中，共有33例(12.79%)患者服氯吡格雷前与服药后血小板聚集率水平的差值不大于10%(氯吡格雷抵抗)，其中快代谢型组中2例(1.67%)，中代谢型组中3例(2.80%)，慢代谢型组中28例(90.32%)。三组比较P=0.038(差异有统计学意义)。

3　讨　论

急性冠脉综合征(ACS)起病凶险，严重威胁人类生命安全及健康。血小板的聚集是ACS 的主要发病机制之一，抗血小板治疗是ACS 治疗的重点。了解患者的血小板功能情况及应用抗血小板药物后血小板的活性状态对于ACS 的治疗有重要意义。但临床上有4%～30%的ACS 患者存在氯吡格雷抵抗,，使得ACS 治疗的困难加大。部分患者在正规的抗血小板治疗下，不能取得预期的疗效，甚至反复发生血栓事件。尤其是行经皮冠状动脉介入治疗(PCI)术后的患者， 氯吡格雷抵抗者容易出现急性或亚急性血管闭塞，增加了终点事件的发生率[10]。不同研究使用的血小板功能检测方法不同，且血小板功能的检测受取血过程、标本检测时间等多个因素影响，结果差异较大。本研究中的ACS患者中，12.79%患者为氯吡格雷抵抗，与文献报道基本一致。

氯吡格雷抵抗的原因，文献报道较多，现已知的有基因多态性(CYP2C19、PON1、ABCB1等)、患者用的药依从性、饮食、吸烟以及药物间相互作用等，其中基因多态性研究较多[11]。氯吡格雷是是一种二磷酸腺苷(adenosine diphosphate，ADP)受体拮抗剂，本身是无活性的前体药物，口服后需要在肝脏经过CYP450酶氧化后成为活性代谢产物，才能发挥其抗血小板作用。CYP2C19是CYP450酶第二亚家族中的重要成员，是人体重要的药物代谢酶，在肝脏中有很多表达。CYP2C19作为CYP450中的一种重要的代谢酶，是影响氯吡格雷在体内代谢的关键因素。CYP2C19基因座位于染色体区10 q 24.2上，由9个外显子构成。其基因多态性决定了该酶活性在个体间存在差异，从而影响氯吡格雷活性产物的浓度及其抗血小板作用。研究[12]发现，CYP2C19基因多态性主要由两类突变引起: 一类是降低酶活性的突变(如CYP2C19*2、*3、*4、*5、*7、*8等); 另一类是增强酶活性的突变(目前仅发现有CYP2C19*17)。根据其表型分为三种代谢型，即慢代谢型( 携带两个降低CYP2C19酶活性的突变位点) 、快代谢型( 快代谢型者则携带两个增强酶活性的突变位点) 和中间代谢型( 只携带一个降低或增强酶活性的突变位点) 。不同代谢型的患者服用氯吡格雷后，对血小板的抑制程度不同。本研究中*1/*1型血小板聚集抑制率最高，*1/*2和*1/*3型中等，*2/*2、*3/*2和*3/*3型抑制率最低。故临床工作中，对于ACS患者进行CYP2C19的基因型检测，可以为抗血小板药物的选择提供依据。

目前基因检测是否能改善患者预后尚无一致结论。这方面多数研究的对象为非ACS患者，部分为非PCI患者，此类患者较稳定，终点事件较少，可能为未能得出阳性结果的原因[13]。然而ADAPT-DES和Fast-MI研究是针对ACS患者所做的观察，发现携带CYP2C19 突变基因的患者发生心血管事件的风险显著增加，特别是在接受PCI 治疗的患者中尤为明显[14-15]。国内赵榆华等报道[16], ST段抬高型心肌梗死的患者，行紧急PCI术前给替格瑞洛组较氯吡格雷组能更好的预防无复流现象。该研究提示，可能部分氯吡格雷低反应性的患者，改用替格瑞洛能更好地抑制血小板功能。本研究观察时间较短，未进行长时间随访，不能得出基因型与终点事件的关系是本文的局限性。

[1] SZAPARY L,KOLTAI K,TIBOLD A,et al. Clopidogrel resistance in cerebrovascular disease-results of one-year follow-up[J]. Orv Hetil,2015,156(10):53-59.

[2] WAND S,BARO D,BAECKER C,et al. Response to dual antiplatelet therapy in patients with peripheral artery occlusive diseasesuffering from critical limb ischemia[J]. Clin Lab,2014,60(8):1601-1607.

[3] 陈希伟，吴同果，韦建瑞，等. 复方丹参滴丸对氯吡格雷抵抗患者血小板聚集功能影响的研究[J]. 广州医药, 2012, 43(2): 26-29.

[4] GAO W,ZHANG Q,GE H,et al. Efficacy and safety of triple antiplatelet therapy in obese patients undergoing stent implantation[J]. Angiology,2013,64(9):554-558.

[5] AL-AZZAM SI, ALZOUBI KH, KHABOUR OF, et al. Factors that contribute to clopidogrel resistance in cardiovascular disease patients:environmental and genetic approach[J]. Int J Clin Pharmacol Ther,2013,51(6):179-186.

[6] SAMOS M, SIMONOVA R, KOVIR F, et al. Clopidogrel resistance in diabetic patient with acute myocardial infarction due to stent thrombosis[J]. Am J Emerg Med, 2014, 32 (3): 461- 465.

[7] PRIYADHARSINI R,SHEWADE DG,SUBRAJA K,et al. Single nucleotide polymorphism of CYP3A5*3 contributes to clopidogrel resistance in coronary artery disease patients among Tamilian population[J]. Mol Biol Rep,2014,41(10):7265-7271.

[8] ANDERSON JL, ADAMS CD, ANTMAN EM, et al. ACC/AHA 2007 guidelines for the management of patients with unstable angina/non-ST-elevation myocardial infarction: A report of the AmericanCollege of Cardiology/American Heart Association Task Force on Practice Guidelines(Writing Committee to Revise the 2002 Guidelines for the Management of Patients With Unstable Angina/Non-ST-Elevation Myocardial Infarction) developed in collaboration with the American College of Emergency Physicians,the Society for Cardiovascular Angiography and Interventions,and the Society of Thoracic Surgeons endorsed by the American Association of Cardiovascular and Pulmonary Rehabilitation and the Society for Academic Emergency Medicine[J]. Circulation, 2012, 126(7):875-876.

[9] ANTMAN EM, HAND M, ARMSTRONG PW, et al. 2007 Focused Update of the ACC /AHA 2004 Guidelines for the Management of Patients With ST.Elevation Myocardial Infarction:A report of the American College of Cardiology/American Heart Association Task Force on Practice Guidelines:Developed in collaboration with the Canadian Cardiovascular Society endorsed by the American Academy of Family Physicians:2007 Writing Group to Review New Evidence and Update the ACC/AHA 2004Guidelines for the Management of Patients With ST-Elevation Myocardial Infarction. Writing on Behalf of the 2004 Writing Committee[J]. Circulation, 2008,1 17(5):296-329.

[10] 李建华，曹剑，范利. 氯吡格雷抵抗临床防治的研究进展[J]. 中华老年心脑血管病杂志,2015, 17(12):1324-1326.

[11] FRELINGER AL, BHATT DL, LEE RD, et al. Clopidogrel pharmacokinetics and pharmacodynamics vary widely despite exclusion or control of polymorphisms (CYP2C19, ABCB1,PON1), noncompliance, diet, smoking, co-medications (including proton pump inhibitors), and pre-existent variability in platelet function[J]. J Am Coll Cardiol, 2013, 61(8): 872-879.

[12] SCOTT SA,SANGKUHL K,GARDNER EE,et al. Clinical pharmacogenetic simplementation consortium guidelines for cytochrome P450-2C19( CYP2C19) genotype and clopidogrel therapy[J]. Clinical Pharmacology and Therapeutics, 2011, 90(5): 328-331.

[13] TRENK D, STONE GW, GAWAZ M, et al. A randomized trial of prasugrel versus clopidogrel in patients with high plateletreactivity on clopidogrel after elective percutaneous coronary intervention with implantation of drug-eluting stents: results of the TRIGGER-PCI (Testing Platelet Reactivity in Patients Undergoing Elective Stent Placement on Clopidogrel to Guide Alternative Therapy With Prasugrel) study [J]. J Am Coll Cardiol, 2012, 59(24): 2159-2164.

[14] SIMON T, VERSTUYFT C, MARY-KRAUSE M, et al. Genetic determinants of response to clopidogrel and cardiovascular events[J]. N Engl JMed, 2009, 360(4): 363-375.

[15] STONE GW, WITZENBICHLER B, WEISZ G, et al. Platelet reactivity and clinical outcomes after coronary artery implantation of drugeluting stents (ADAPT-DES): a prospective multicentre registry study[J]. Lancet, 2013, 382(9): 614- 623.

[16] 赵榆华，傅宴，雷婷，等. 替格瑞洛联合比伐卢定对STEMI急诊PCI无复流临床研究[J]. 现代医院, 2014, 14(8):30-32.

Study of CYP2C19 gene polymorphisms influencing on platelet aggregation rate

ObjectiveTo explore the relationship between platelet aggregation rate and CYP2C19 gene polymorphisms.MethodsA total of 258 cases diagnosed as acute coronary syndrome (ACS) from January 2015 to March 2016. The platelet aggregation rate was tested before and 3 days after taking clopidogrel. CYP2C19 gene polymorphisms was tested by Gene chip hybridization technique.ResultsThe platelet aggregation rate before and after taking clopidogrel was(58.76±15.45)% vs(35.17±10.26)% and(59.35±11.58)% vs(47.66±12.59)%(P<0.05)in EM group and IM group. But there was no change in PM group. The PM group were associated with a significant increase risk of clopidogrel resistance compared with EM group and IM group.ConclusionCYP2C19 gene polymorphisms influence the rate of platelet aggregation rate after taking clopidogrel and are associated with clopidogrel resistance in ACS patients.

Clopidogrel; Gene polymorphism; CYP2C19; Acute coronary syndrome

广东省科技厅计划项目(2012B031800341)

吕磊，E-mail:13826255547@139.com

10.3969/j.issn.1000-8535.2016.05.007

2016- 05-23)