miR-221在前列腺癌细胞中的表达及对增殖的影响

毕学成　刘久敏　冯自卫　吴永定

1　广东省人民医院泌尿外科(广州 510080)2　广州医科大学公共卫生学院(广州 510180)

Bi Xuecheng, Liu Jiumin, Feng Ziwei.

Department of Urology, Guangdong General Hospital, Guangzhou 510080, China

Wu Yongding.

School of Public Health, Guangzhou Medical University, Guangzhou 510180, China



·论著·

miR-221在前列腺癌细胞中的表达及对增殖的影响

毕学成1刘久敏1冯自卫1吴永定2

1广东省人民医院泌尿外科(广州 510080)2广州医科大学公共卫生学院(广州 510180)

目的研究前列腺癌细胞中miR-221的表达情况及其对癌细胞增殖的影响。方法运用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测miR-221在前列腺正常细胞株与前列腺癌细胞株中表达的差异情况，利用细胞转染构建miR-221过表达LNCaP和DU145细胞株，再通过CCK8细胞增殖实验检测细胞增殖情况的变化。结果qRT-PCR检测细胞株发现miR-221在PC3、LNCaP和DU145三种前列腺癌细胞株中表达量均比前列腺正常细胞株PrEC低 (F=254.197，P<0.001)，其中两两比较差异也均有统计学意义。细胞转染技术构建的miR-221过表达LNCaP和DU145细胞株，经qRT-PCR结果显示，miR-221在LNCaP和DU145细胞株中的表达水平明显升高(LNCaP,倍数变化=2.24,t=3.46,P<0.01；Du145,倍数变化=2.24,t=4.29,P<0.01)。细胞增殖实验结果显示，过表达了miR-221的LNCaP(P<0.001)和DU145(P<0.001)细胞生长速度慢于对照组。结论实验证明miR-221表达过度能减慢前列腺癌细胞的增殖，miR-221有可能成为前列腺肿瘤治疗的生物学标志物。

前列腺癌miR-221细胞增殖

BiXuecheng,LiuJiumin,FengZiwei.

DepartmentofUrology,GuangdongGeneralHospital,Guangzhou510080,China

WuYongding.

SchoolofPublicHealth,GuangzhouMedicalUniversity,Guangzhou510180,China

前列腺癌(prostate cancer，PCa)是欧美国家最重要的男性恶性肿瘤之一，在亚洲地区发病率仅次于肺癌，且近20年来发病率不断呈现上升趋势，是男性癌死亡的主要原因之一[1]。前列腺癌的发生发展与环境的刺激和基因的变异有密切关联[2]。从现代分子生物学水平出发，寻找与前列腺癌发生发展相关性更密切的标记物，并应用于临床实践的指导，是一项对临床和社会都有重大意义的任务。目前临床上对前列腺癌的筛查或早期诊断，主要通过血清前列腺特异性抗原(PSA)水平。但是PSA作为早期诊断的标记物，仍缺乏最佳的敏感性和特异性。所以寻找新的前列腺癌分子诊断标记物来辅助或最终替代PSA作为前列腺癌的早期诊断标记，一直是肿瘤研究的热点[3]。

Brio等运用基因芯片及Northern blot等实验方法, 检测到乳腺癌组织中miR-221低表达[4]，Gu Y等通过生物信息学分析得出miR-221在前列腺癌中低表达[5]。人们推测miRNA表达改变与肿瘤发生密切相关, 它们常常定位于肿瘤相关区域, 可能同时具有癌基因和抑癌基因的双重作用。当miRNA过度表达时, 抑制了抑癌基因的表达；而miRNA表达过少或缺失时，则不能有效地抑制癌基因。

进一步深入研究和探索介导前列腺癌进展和转移的分子生物学机制，正确判断前列腺癌的恶性程度及预后，为前列腺癌的分子靶向治疗提供理论依据，是泌尿外科疾病研究的热点问题。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1细胞株与实验动物3种前列腺癌细胞株(PC3/DU145/LNCaP)是2012年从美国马纳萨斯(Manassas, VA, USA)的American Type Culture Collection (ATCC)购买得到，而良性的前列腺上皮细胞系PREC是从Lonza公司购买，从公司购买的细胞株均由公司负责鉴定和包装，并在细胞复苏3个月内送到实验室。所有细胞株均在10% FBS、5%CO2、37℃的条件下培养。

1.1.2主要试剂细胞培养所需试剂全部购于Gibco公司，核酸蛋白提取试剂盒以及PCR试剂盒全部购于TaKaRa公司，FuGENE转染试剂购于Promega公司，全部引物购于广州复能基因有限公司(货号：miR-221：HmiRQP0337，内参U6：HmiRQP9001)，CCK8试剂购置碧云天生物技术研究所。

1.2方法

1.2.1SYBR GreenⅠ染料法实时定量荧光PCR(qRT-PCR)使用PC3、DU145、LNCaP及PREC细胞株mRNA的反转录产物cDNA 为模板，分别进行荧光定量PCR扩增目的基因，检测并验证miR-221在前列腺癌细胞中的表达水平。

反应体系20 μl：

cDNA2 μl

Primer Mix0.8/0.8 μl

SYBR GreenⅠMaster Mix10 μl

超纯水6.4 μl

反应条件：

在55℃ 时收集荧光信号

利用Livak(2-△△Ct)法进行目的基因的定量分析：

用内参基因的Ct值目的基因的Ct值进行归一化处理：

△Ct前列腺=Ct(前列腺，目标基因)-Ct(前列腺，内参基因)

△Ct对照组= Ct(对照组，目标基因)-Ct(对照组，内参基因)

对照组样品的△Ct值归一前列腺癌细胞的△Ct值：

△△Ct = △Ct前列腺-△Ct对照组

计算相对表达水平：

2-△△Ct=表达量的比值(相对表达量)

1.2.2细胞株构建miR-221过表达与重组表达质粒构建(由复能基因公司完成)；将重组表达质粒在293T细胞株中利用HIV慢病毒包装系统包装病毒颗粒，再收集病毒颗粒感染目的细胞，最后进行流式分选，筛选出带绿色荧光的阳性细胞继续培养并通过qRT-PCR验证。

1.2.2.1重组表达质粒病毒包装用无抗生素培养基培养293TN细胞(10 cm plate)18～24 h，细胞密度达到60%后转染。加0.8 mL的DMEM(无血清)到已高压灭菌的EP管。加20 μl pPACKH1 and 2 μg的慢病毒载体到DMEM，混匀。加24 μl PureFection到EP管，Vortex 10 secs。DMEM-Plasmid-PureFection室温孵育15min。DMEM-Plasmid-PureFection 滴入培养皿里，混匀。放入37℃、5% CO2培养箱培养。转染48～72 h后，收集培养基(含病毒颗粒)到50 mL的离心管，室温离心3000 g 15 mins。取病毒上清到新的管子里。每1体积的5×PEG-it加4体积的有慢病毒载体的上清，4℃过夜。1500 g 4℃离心5 min，收集沉淀。用预冷的PBS溶解病毒液，按上清的1/100溶解，放-80℃冰箱保存。

1.2.2.2慢病毒转染加4 μl 1×TransDux，慢病毒溶液40 μl到新鲜培养基(800 μl)中转染靶细胞(6孔板)。第二天再补加新鲜培养基到6孔板中，37℃、5% CO2培养箱培养48h。进行流式分选，筛选出带绿色荧光的阳性细胞继续培养。

1.2.3细胞增殖实验细胞消化后，用培养液充分打匀后配成单个细胞的悬液，接种细胞到96孔板，每孔1000～10000个/200 μl。分别培养24 h、48 h及72 h后，加CCK8溶液20 μl置每个孔中。再继续孵育4小时后终止培养，充分离心后吸掉孔内上清液。选择490 nm的波长，用酶联免疫监测仪测定各孔光吸收值(OD值)，并记录结果，结果用均数±标准差表示，以吸光值为纵坐标，时间为横坐标，绘制细胞的生长曲线。

2　结　果

2.1miR-221在各种前列腺细胞株中的基因表达情况实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测人类前列腺癌细胞株LNCap、DU145、PC3和人类正常前列腺上皮细胞株PrEC中miR-221的表达情况，结果显示相对PrEC,在LNCap、DU145和PC3三种前列腺癌细胞株中均有表达量减少(F=198.742，P<0.001)，其中在LNCaP细胞中表达水平最低(见图1)。

图1　miR-221在前列腺癌细胞株的表达量减少

2.2qRT-PCR检测细胞株构建情况qRT-PCR检测转染后目标细胞株miR-221的表达情况，经方差分析，过表达细胞株中miR-221的表达水平高于对照组(LNCaP,倍数变化=2.24,t=3.46,P<0.01；Du145,倍数变化=2.24,t=4.29,P<0.01,见图2)，过表达组与野生型的差异也都有统计学意义，可以用于下一步的功能研究。

2.3miR-221对前列腺癌细胞增殖的影响运用细胞增殖实验CCK8进一步探讨miR-221表达与前列腺癌增殖的关系，发现miR-221过表达的LNCaP(P<0.01)和DU145(P<0.01)细胞在24 h、48 h和72 h生长速度慢于对照组(见图3)。这结果表明，NEK2可抑制前列腺癌细胞增殖。

图2　转染质粒后细胞中miR-221的表达情况

图3　LNCap细胞在24 h,48 h,72 h的增殖(左)DU145细胞在24 h,48 h,72 h的增殖(右)

3　讨　论

近年来由于环境、生活习惯等因素影响，国内发病逐渐上升，但是对于前列腺癌症的发生和扩散机制，以及对于前列腺癌这种恶性肿瘤的治疗、诊断尚缺少较为有效的方式，PSA作为诊断指标也存在一定局限性。实现肿瘤的早期珍断，以及阐明前列腺癌的相关发病以及调节机制，对于寻找能够遏制前列腺癌的发生、发展药物以及分子靶标，成为泌尿外科疾病研究的热点问题。

自Tomlins等[6]利用异常癌基因表达谱分析 (cancer outlier profile analysis,COPA) 技术发现前列腺癌中TMPRSS2-ERG融合基因的存在以来，现已基本明确近50%的前列腺癌中存在TMPRSS2-ERG基因融合。在增生和PIN中亦有不同程度的TMPRSS2-ERG融合存在，TMPRSS2-ERG有望成为主要的前列腺癌早期发现和诊断的指标。研究表明TMPRSS2-ERG在肿瘤的早期发生中起作用，在很多肿瘤中高表达，与肿瘤的血管生成、转移、程润、抑制调亡有关，ERG基因在前列腺癌中主要受TMPRSS2-ERG融台基因的调节，但具体作用机制尚不清楚。另一方面，有报道表明，在TMPRSS2-ERG的前列腺癌样本中miR221下调表达。而大量的前列腺癌样本中发现，出现TMRRSS2-ERG融合基因转录的同时，伴随着miR-221表达的下调[7]。这一发现给我们提供了一条前列腺癌研究的新线索--表达下调的miR-221与高表达的TMPRSS2-ERG融合基因之间是否存在某种联系，而这种联系使miR-221出现低表达，这对前列腺癌的发生、发展、增殖以及治疗疗效、预后转归有何影响？

miRNA是一组保守的非编码小RNA (non-coding small RNA) ,长约22nt 的非编码的单链RNA分子， 广泛分布在病毒、植物到高等哺乳动物中[8]， 大约相当于每种生物体蛋白编码基因的1%[9]。目前, miRNA 已知的功能是在转录后水平调控基因的表达, 主要作为基因表达的负调控因子，即通过抑制靶基因的翻译而起调控作用[10]。因此本研究从miR-221入手，探索miR-221在前列腺癌中下调表达的证据及其对细胞增殖的抑制作用。

但是肿瘤的发生是个复杂的过程，还需要做大量的工作才能更好的理解miR-22在肿瘤的发生中所起的作用，后期研究我们将结合TMPRSS2-ERG融合基因，探讨miR-221抑制前列腺肿瘤细胞增殖的作用机制，为前列腺癌从TMPRSS2-ERG融合基因调控层次上以miR-221为切入点的治疗提供新的作用靶点及科学依据。

[1] SIEGEL RL, MILLER KD, JEMAL A. Cancer statistics, 2016[J]. CA Cancer J Clin，2016，66(1):7-30.

[2] DEMARZO AM, NELSON WG, ISAACS WB, et al. Pathological and molecular aspects of prostate cancer[J]. Lancet，2013,361:955-964.

[3] CAI C, CHEN QB, HAN ZD, et al. miR-195 inhibits tumor progression by targeting RPS6KB1 in human prostate cancer[J]. Clin Cancer Res, 2015， 21(21):4922- 4934.

[4] LI B, LU Y, WANG H，et al. miR-221/222 enhance the tumorigenicity of human breast cancer stem cells via modulation of PTEN/Akt pathway[J]. Biomed Pharmacother，2016，79:93-101.

[5] GU Y, LEI D, QIN X，et al. Integrated Analysis Reveals together miR-182, miR-200c and miR-221 Can Help in the Diagnosis of Prostate Cancer[J]. PLoS On，2015，10(10):e0140862.

[6] TOMLINS SA, RHODES DR, PERNER S, et al. Recurrent fusion of TMPRSS2 and ETS transcription factor genes in prostate cancer. Science, 2015, 310 (5748):644- 648.

[7] GORDANPOUR A, STANIMIROVIC A, NAM RK, et al. miR-221 Is down-regulated in TMPRSS2:ERG fusion-positive prostate cancer[J]. Anticancer Res, 2011，31(2):403- 410.

[8] DUARTE FV, PALMEIRA CM, ROLO AP. The Emerging Role of MitomiRs in the Pathophysiology of Human Disease[J]. Adv Exp Med Biol, 2015,888:123-154.

[9] GRIFFITHS-JONES S. The miRNA registry[J]. Nucl Acids Res, 2004，32: D109-111.

[10] CARROLL AP, GOODALL GJ, LIU B. Understanding principles of miRNA target recognition and function through integrated biological and bioinformatics approaches[J]. Wiley Interdiscip Rev RNA，2014，5(3):361-379.

Effect of miR-221 expression on proliferation in prostate cancer cells

ObjectiveTo investigate miR-221 expression in prostate cancer cells and its influence on prostate cancer cell proliferation.MethodsmiR-221 expressions in prostate normal cell lines and cancer cell lines were measured by qRT-PCR. Overexpression of the miR-221 in LNCaP and DU145 cell lines used by cell transfection. Effects of the depletion on cell proliferation were assessed in vitro with CCK8.ResultsqRT-PCR showed miR-221 was lower expressed in PC3, LNCaP and DU145 than in PrEC(F=254.197,P<0.001), in which pairwise comparison also had significant differences. qRT-PCR showed miR-221 expression rose significantly in LNCaP and DU145 cell lines whose miR-221 was overexpression with cell transfection(LNCaP, Fold Change=2.24,t=3.46,P<0.001；Du145, Fold Change=2.24,t=4.29,P<0.001). Cell proliferation assay showed that growth of LNCaP(P<0.001) and DU145(P<0.001) cells whose miR-221 was overexpression was slower than the control group.ConclusionThis study demonstrates miR-221 overexpression can inhibited the proliferation of prostate cancer cells for the first time, it also suggests that miR-221 has the potential to serve as a biomarker for PCa therapy.

Prostate cancer; miR-221; Cell proliferation

广东省医学科学技术研究基金项目(A2014016)

毕学成，E-mail：doctorbi1975@163.com

10.3969/j.issn.1000-8535.2016.05.001

2016- 04- 05)