铬离子单克隆抗体的制备及食品总铬含量检测胶体金免疫层析试纸条的研制

王亚楠,王晓斐,丁　菡,张海棠,范国英,王自良,*

(1.河南科技学院动物科学学院,河南新乡 453003;2.河南科技学院新科学院,河南新乡 453003)



铬离子单克隆抗体的制备及食品总铬含量检测胶体金免疫层析试纸条的研制

王亚楠1,王晓斐2,丁菡1,张海棠1,范国英1,王自良1,*

(1.河南科技学院动物科学学院,河南新乡 453003;2.河南科技学院新科学院,河南新乡 453003)

目的:制备三价铬离子螯合物单克隆抗体(Cr3+-EDTA mAb),研制胶体金免疫层析试纸条(Cr-Strip)。方法:用异硫氰酯法合成Cr3+-iEDTA-BSA,UV和ICP-AES进行鉴定;细胞融合技术筛选Cr3+-EDTA mAb细胞株,体内诱生腹水法制备Cr3+-EDTA mAb,并对其特性进行分析;应用Cr3+-EDTA mAb研制Cr-Strip,并测定其性能。结果:筛选出3株杂交瘤,最好的是2A11G5,Ka为2.69×109L/mol,对Cr3+-EDTA的IC50为9.84 μg/L,与其他重金属离子无交叉反应;Cr-Strip的检测时间为10 min,检测限为5 μg/L,其检测结果与ICP-AES符合率为100%。结论:制备出了高质量的Cr3+-EDTA mAb,研制出更为灵敏的Cr-Strip。

Cr3+,免疫原,单克隆抗体,胶体金免疫层析,总铬含量

近年来,由于我国对铬资源利用不够科学和缺乏相应保护措施,铬对环境与食品的污染日趋加重[1]。国家环境保护部和国土资源部2014年4月联合发布的《全国土壤污染调查公报》显示,在调查的81块工业废弃地的775个土壤样品中,铬作为主要污染物超标34.9%[2]。2014年9月发生在浙江省的“毒胶囊”事件,铬超标65倍,再次引发政府和社会对铬污染超标的广泛关注。

由于铬对人体健康具有肝脏[3]、肾脏[3]、遗传[4]、神经[5]和致癌[6]等多种毒性作用,尤其是Cr6+是Cr3+毒性的100倍[7]。我国为了严格控制铬对食品的污染,卫生部发布了《GB 2762-2011食品中污染物限量标准》,铬限量标准为水产动物及其制品≤2.0 mg/kg;谷物及其制品≤1.5 mg/kg;蔬菜及其制品≤0.5 mg/kg;豆类及其制品≤1.0 mg/kg;肉及肉制品≤1.0 mg/kg。目前,国内外对环境与食品样品中总铬含量的检测主要采用理化分析方法,如石墨炉原子吸收光谱法(GFAAS)[8]、火焰原子吸收光谱法(FAAS)[9]、电感耦合等离子体质谱法(ICP-MS)[10]和电感耦合等离子体原子发射光谱法(ICP-AES)[11]等,这些方法虽然精密度高,但由于仪器、技术、场地、成本等方面的制约,不便推广应用。

图1　免疫原Cr3+-iEDTA-BSA合成路线Fig.1　Synthesis scheme of immunogen Cr3+-iEDTA-BSA

胶体金免疫层析技术(GICA)是近年来发展起来的一项成熟先进的检测技术,在食品安全检测领域发挥了重要作用。国外Sasaki等[12]研制出了铬离子免疫检测器,检测限达到1.6 μg/L;国内颜露等[13]研制了抗Cr3+单克隆抗体;刘茜等[14]研究报道了铬离子GICA检测方法,但由于检测限较高(50 μg/L),不能很好满足实际检测工作需要。本研究旨在制备稳定性好、亲和力高、识别能力强的Cr3+与EDTA螯合物单克隆抗体(Cr3+-EDTA mAb),研制更加灵敏的食品总铬GICA试纸条检测方法(Cr-Strip)。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

SPF级4周龄雌性Balb/C小鼠5只,编号为M1～M5,新乡医学院实验动物中心提供,动物许可号:SCXK(豫)2010-0002;鼠源骨髓瘤细胞NS0农业部动物免疫学重点实验室提供;重金属氯化铬、氯化镉、氯化汞、氯化铝、硫酸铜、硫酸铁、硫酸锰、硝酸铅、硝酸锌标准品购自郑州大学耐火材料研究所,均为AR级;免疫原Cr3+-iEDTA-BSA、包被抗原Cr3+-iEDTA-OVA本课题组制备;弗氏佐剂CFA、IFASigma产品;细胞培养基RPMI-1640、HAT、HT和PEG-2000Gibco产品;氯金酸(HAuCl4·3H2O)、柠檬酸三钠(Na3C6H5O7·2H2O)Pierce产品;硝酸纤维素膜(NC膜)、玻璃纤维棉、样品垫Millipore公司;其它试剂AR级;实验用水去离子水;待测样品河水样18份、大米样30份、面粉样30份、猪肉样24份、虾仁12份、大白菜16份共130份课题组分别从新乡市、焦作市、鹤壁市、安阳市采集。

UV-2450紫外扫描仪日本岛津公司;Ultrospec 2000核酸蛋白分析仪美国Amersham Pharmacia公司;Optima 2100DV型ICP-AES美国PE公司;H-600透射电镜日本HITACHI公司;X-only单向喷点仪、CM4000切槽仪美国Biodot公司。

1.2实验方法

1.2.1免疫原合成参照Kuang等[15]所述的异硫氰酯法加以改进合成免疫抗原Cr3+-iEDTA-BSA,如图1所示。

1.2.2免疫原鉴定紫外扫描鉴定:用Hepes溶液配置浓度为1 mg/mL BSA溶液,EDTA浓度为1 mg/mL Cr3+-iEDTA溶液,载体蛋白浓度为1 mg/mL的Cr3+-iEDTA-BSA溶液,在波长220～400 nm范围内进行紫外扫描。

载体蛋白BSA与Cr3+质量浓度测定:用Hepes溶液配制载体蛋白BSA浓度为20 mg/mL的Cr3+-iEDTA-BSA溶液,倍比稀释,浓度为20、10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125 mg/mL,用Ultrospec 2000核酸蛋白分析仪在278 nm测定Cr3+-iEDTA-BSA中BSA的质量浓度;用ICP-AES测定Cr3+的质量浓度,参照张丽萍[16]所述的方法进行,ICP-AES工作条件为射频频率40.68 Hz,正向功率1.0 kW,冷却气流量16.0 L/min,辅助气流量1.0 L/min,载气流量0.7 L/min,延迟时间30 s,积分时间5 s,分析线267.72 nm,线性回归方程为y=985.2x-14.5,R2为1.0,检测范围为0.005～200.0 mg/L,检测限为5 μg/L。

1.2.3Cr3+-EDTA mAb的制备选择细胞融合小鼠:用Cr3+-iEDTA-BSA按正常程序免疫5周龄雌性Balb/C小鼠5只,免疫5次,时间间隔4周,最后1次免疫后第28 d断尾采血分离血清,间接ELISA测定多抗血清效价,以此判定免疫效果;用icELISA测定多抗血清对Cr3+-EDTA的抑制效价,以50%抑制浓度(IC50)判定敏感性,选择多抗血清效价<1:(1×104)且对Cr3+-EDTA半数抑制浓度(IC50)最小的小鼠用于细胞融合。

细胞融合与杂交瘤细胞株的筛选:按常规方法将免疫脾细胞与NS0瘤细胞以1∶10比例混合,在500 mL/L PEG-1500作用下进行融合、筛选和克隆化[17],待确定杂交瘤细胞已单克隆化,用间接ELISA和间接竞争ELISA进行阳性杂交瘤细胞筛选,建立细胞株,冻存于液氮备用。Cr3+-EDTA mAb制备:体内诱生腹水法制备Cr3+-EDTA mAb[18]。

1.2.4Cr3+-EDTA mAb特性分析稳定性分析:将冻存的3株杂交瘤细胞2A3C11、2A3D9、2A11G5和鼠源骨髓瘤细胞NS0,每间隔10 d复苏并传代1次,共传代9次,每次传代用间接ELISA检测不同代次细胞培养上清中抗体效价情况,以测定杂交瘤细胞分泌抗体的稳定性。

亲和性分析:按照Kim等[19]所述Batty饱和法测定亲和常数(Ka),按式(1)进行计算。

式(1)

式中:Ka为亲和常数;n为每组中包被抗原Cr3+-iEDTA-OVA两个包被浓度的稀释倍数;[Ab]t为抗原浓度为[Ag]t时50% Amax对应的抗体浓度;[Ab′]t表示抗原浓度为[Ag′]t时50% Amax对应的抗体浓度。

灵敏性分析:间接竞争ELISA测定Cr3+-EDTA mAb对Cr3+-EDTA的半数抑制浓度(IC50),确定其灵敏性。

特异性分析:间接竞争ELISA测定Cr3+-EDTA mAb对Cd2+、Hg2+、Al3+、Cu2+、Fe3+、Mn2+、Pb2+、Zn2+等金属离子与EDTA的螯合物及EDTA的交叉反应率,按式(2)进行计算。

式(2)

式中:CR为交叉反应率;P为Cr3+-EDTA mAb对Cr3+-EDTA的IC50;P1为金属离子与EDTA的螯合物及EDTA的IC50。

1.2.5Cr-Strip研制

1.2.5.1胶体金的制备参照Song等[20]所述的檬酸钠还原法制备胶体金,用紫外扫描及透射电镜扫描,观察胶体金分散均匀度及粒径大小。

1.2.5.2金标抗体的制备采用Mey氏系列稳定法[21]制备金标抗体,用紫外扫描,观察金标抗体吸收峰位置的变化并与胶体金吸收峰位置进行比较。

1.2.5.3金标抗体玻璃纤维棉的制备用PBS配制含1%的BSA和0.05%吐温-20的溶液浸泡玻璃纤维棉,晾干,将金标抗体用X-only单向喷点仪均匀喷洒于玻璃纤维棉上。

1.2.5.4NC膜的制备X-only单向喷点仪将浓度为1 mg/mL的免疫原Cr3+-iEDTA-BSA和浓度为1 mg/mL的RaMIgG点射于NC膜中央,形成间距0.5 cm的检测线(T线)和质控线(C线),自然干燥,密封。

1.2.5.5试纸的组装在支持板上首先粘贴上NC膜和吸水纸,此后依次粘贴上金标垫和样品垫,之后用切条机裁割,37 ℃真空干燥箱干燥12 h,与干燥剂一起密封,4 ℃保存备用。

1.2.5.6Cr3+-EDTA标准品制备与待测样品预处理由于所制备的Cr3+-EDTA mAb是针对Cr3+-EDTA的,取等体积的Cr3+标准品溶液(1000 μg/L)与EDTA(1 mol/L)混合,静置10 min,使Cr3+充分螯合,之后用PBS稀释成5 μg/L;液体样品如水样、尿样、血液样、牛奶样等,首先在液体样品中加入10 mL浓度为1 mol/L、pH9.5的Na2SO3溶液,将Cr6+全部还原为Cr3+,之后加入10%体积摩尔浓度为0.1 moL/L的EDTA鳌合剂,混合反应30 min,使Cr3+与EDTA充分鳌合,5000 r/min离心10 min,取上清液进行检测;固体样品如土壤样、大米样、面粉样、组织样等,称取1.0 g样品于100 mL锥形瓶内,加入1 mL双蒸水浸润后加入混酸溶液6 mL(3 mL浓H3PO4和3 mL浓H2SO4),盖上表面皿,置于电炉上加热至冒白烟,冷却后加入0.5 mL浓HNO3,继续加热至土样变白色、消解液呈黄绿色,用双蒸水冲洗,全部转移入50 mL离心管内,5000 r/min离心10 min,将上清夜移入100 mL容量瓶中,加入10 mL浓度为1 mol/L、pH9.5的Na2SO3溶液,搅拌反应1 h,将Cr6+全部还原为Cr3+,之后加入10 mL浓度为0.1 mol/L的EDTA鳌合剂溶液,搅拌反应8 h,定容至100 mL,得到样品检测溶液。

1.2.6Cr-Strip性能测定

1.2.6.1敏感性用PBS配制1000 μg/L的Cr3+溶液与1 mol/L的EDTA等体积混合,得出浓度为500 μg/L的Cr3+-EDTA的溶液,用PBS稀释,配制终浓度分别为160.0、80.0、40.0、20.0、10.0、5.0、2.5、1.0、0 μg/L的Cr3+-EDTA标准溶液,用Cr-Strip测定,根据测定结果判断其敏感性。实际检测时,将样品加到Cr-Strip样本垫上,室温反应10 min,观察显色结果。结果判定方法:T线、C线均显示红色,样品呈阴性;T线不显示红色、C线显示红色,则呈阳性;T线、C线均不显示红色,则检测失败。

1.2.6.2重复性取不同批次的6批Cr-Strip,分别在6 d对Cr3+-EDTA浓度为1.0、5.0、10.0、20.0 μg/L的水样、面粉样、猪肉样进行检测,检验其稳定性。

1.2.6.3稳定性将Cr-Strip置4 ℃冰箱中密封保存12个月,每隔1个月检查一次活性,用PBS(阴性)和Cr3+-EDTA质量浓度5 μg/L样品检测,测定其稳定性。

1.2.6.4实际应用与复核实验待测样品130份分别用Cr-Strip和ICP-AES进行检测,测定其符合率,ICP-AES检测参照张丽萍[18]所述的方法进行,检测限为5 μg/L。

2　结果与讨论

2.1免疫原鉴定

2.1.1紫外扫描鉴定结果见图2。BSA在278 nm出现特征峰,Cr3+-iEDTA在264、332 nm出现特征峰,Cr3+-iEDTA-BSA在272、332 nm出现特征峰,紫外扫描鉴定结果表明,Cr3+-iEDTA-BSA兼有BSA和Cr3+-iEDTA的特征峰,说明Cr3+-iEDTA-BSA中同时含有BSA和Cr3+,由此可推断免疫原合成成功。

图2　BSA、Cr3+-iEDTA和Cr3+-iEDTA-BSA的紫外扫描图Fig.2　The UV spectra of BSA,Cr3+-iEDTA and Cr3+-iEDTA-BSA

2.1.2BSA与Cr3+含量测定紫外扫描仪278 nm测定Cr3+-iEDTA-BSA中BSA的含量为5.81 g/L,ICP-AES测定Cr3+的含量为140.8 mg/L。测定结果表明,Cr3+-iEDTA-BSA中同时含有BSA和Cr3+,说明免疫原合成成功。

2.2Cr3+-EDTA mAb制备

2.2.1细胞融合小鼠选择结果见图3、图4。用间接ELISA测定5只免疫小鼠多抗血清效价,均达到了1:(1×104),说明用Cr3+-iEDTA-BSA免疫Balb/C小鼠,获得了理想的免疫效果,其中M1免疫效果最好,多抗血清效价最高达到了1:(5.12×104)。用间接竞争ELISA测定多抗血清对Cr3+-EDTA的抑制效价,5只免疫小鼠多抗血清对Cr3+-EDTA均能抑制,其中M1抑制效果最好,IC50最低为24.8 μg/L,说明M1多抗血清对Cr3+-EDTA的敏感性也最好。由于M1多抗血清效价最高且敏感性好,故选择M1进行细胞融合。

图3　抗Cr3+-EDTA多抗血清效价测定曲线Fig.3　Titer curves of Cr3+-EDTApAb determined by indirect ELISA

图4　Cr3+ pAb对Cr3+的抑制曲线Fig.4　Inhibitory curves of Cr3+ pAb againstCr3+ dermined by blocking ELISA

2.2.2杂交瘤细胞株建立融合细胞经3次克隆化后阳性率达100%,间接ELISA分别测定其IC50,筛选出3株高效价、敏感、特异的杂交瘤,分别命名为2A3C11、2A3D9、2A11G5。

2.3Cr3+-EDTA mAb特性分析

2.3.1杂交瘤稳定性分析结果见图5。杂交瘤细胞分泌抗体的稳定性是由其遗传物质染色体核型所决定的,图5可知,3株杂交瘤冻存前细胞培养上清效价测定吸收值与9次冻存、复苏、传代培养后上清效价基本一致,说明3株杂交瘤分泌抗体稳定性好。

图5　细胞传代培养上清中抗体效价变化Fig.5　The indirect ELISA titer of mAb secretedby hybridomas continually in the supernatants

2.3.2亲和性分析结果见图6。2A3C11、2A3D9、2A11G5的Ka分别为7.85×108、1.03×109、2.69×109L/mol,其中2A11G5的Ka最大。亲和性是由抗体与对于抗原反应结合强度即亲和力大小所决定的,根据Velankia等[22]Ka为107～1012L/mol为高亲和力抗体、Ka为105～107L/mol为低亲和力抗体的研究结论,本实验所制备的Cr3+-EDTA mAb均为高亲和力抗体,其中2A11G5的亲和性最好。

图6　Cr3+-EDTA mAb的Ka测定曲线Fig.6　The association constant cueve of Cr3+-EDTA mAb

2.3.3灵敏性分析结果见图7。抑制曲线的回归方程为y=-31.766x+81.522,由此可计算出亲和力最高的2A11G5株所产生的Cr3+-EDTA mAb对Cr3+-EDTA的IC50值为9.84 μg/L,为高灵敏性抗体。

图7　灵敏性测定Fig.7　The sensitivity measurement of anti-Cr3+-EDTA mAb

2.3.4特异性分析结果见表1。Cr3+-EDTA mAb对Cr3+-EDTA的IC50为9.84 μg/L,对EDTA及其它金属离子的IC50均大于103,说明Cr3+-EDTA mAb具有较高的特异性。特异性是由抗体分子超变区空间结构与抗原决定簇之间的互补性决定的,Alzari等[23]研究证实,抗体识别抗原构象型表位的范围是160～900 Å,Cr3+的晶体构象小于3 Å而不被抗体识别[24],Cr3+-EDTA则属于半抗原,可与抗体发生特异性结合反应,抗体识别半抗原的部位是抗体轻链超变区的组氨酸残基[25],本实验所研制的Cr3+-EDTA mAb可专一识别Cr3+-EDTA螯合物,与其他化合物无交叉反应性。

表2　Cr3+-EDTA mAb与胶体金最佳标记浓度的选择

表1　Cr3+-EDTA mAb与EDTA及其他金属离子的交叉反应

2.4胶体金与金标抗体质量鉴定

2.4.1胶体金紫外扫描鉴定结果见图8。胶体金的吸收峰(λmax)位于523.8 nm,最大吸光值(Amax)为0.941,只有一个吸收峰,峰宽较小,根据Zhou等[26]的研究结果说明,胶体金颗粒大小及分布均匀,粒径为25 nm。

图8　胶体金紫外扫描图Fig.8　Determination of colloidal gold by spectrophotometry

2.4.2胶体金透射电镜扫描鉴定结果见图9。所制备的胶体金在透射电镜下分布均匀,形状规则,随机测量100个颗粒,粒径在(25±1.0) nm,与紫外扫描结果基本一致。

图9　胶体金电镜扫描结果Fig.9　Determination of colloidal gold by electron microscope

2.4.3金标抗体单抗最佳用量的确定结果见表2。Cr3+-EDTA mAb与胶体金标记的适宜浓度为6.25 μg/mL,在此基础上增加10%,Cr3+-EDTA mAb最佳标记浓度为7.0 μg/mL胶体金。

2.4.4金标抗体紫外鉴定结果见图10。胶体金与金标抗体均只有一个吸收峰,胶体金的吸收峰(λmax)位于523.8 nm,金标抗体的吸收峰位于530 nm,吸收峰发生了偏移,可以判定抗体标记成功。

图10　金标抗体紫外扫描图Fig.10　Determination of Cr3+-EDTA mAb labeledwith colloidal gold by spectrophotometry

2.5Cr-Strip性能测定

2.5.1敏感性测定结果见图11。当样品中Cr3+-EDTA质量浓度达到2.5 μg/L时,T线相对阴性对照颜色明显变浅,当样品中Cr3+-EDTA质量浓度达到5 μg/L时,T线颜色基本消失,呈现强阳性,因此,Cr-Strip的检测限为5 μg/L。

表3　Cr-Strip重复性测定(n=6)

注:“-”代表阴性;“+”代表阳性。

表4　Cr-Strip与ICP-AES实际检测结果比较

图11　Cr-Strip敏感度测定(n=6)Fig.11　Sensitivity of Cr-Strip(n=6)注:1～9表示Cr3+-EDTA质量浓度,分别为0、1.0、2.5、5.0、10.0、20.0、40.0、80.0、160.0 μg/L。

2.5.2重复性测定结果见表3。不同批次的6批Cr-Strip对水样、面粉样、猪肉样进行重复性测定,检测结果完全一致,说明Cr-Strip的重复性好。

2.5.3稳定性测定制备的Cr-Strip在4 ℃、12个月的保存期内,其外观和准确性等均末发生变化,C线和T线条带显色清晰,与新制备的Cr-Strip检测结果完全一致,说明Cr-Strip可在4 ℃条件下密封保存12个月。

2.5.4符合性测定结果见表4。在130份样品中共检出15份阳性样品,Cr-Strip与ICP-AES的检测结果一致,均为15份样品,符合率为100%;15份阳性样品用Cr-Strip半定量测定,用ICP-AES定量测定,Cr-Strip的阳性值≥5 μg/L,ICP-AES测定的阳性范围值为5.9～98.7 μg/L,说明Cr-Strip的敏感性与ICP-AES相当;猪肉样品阳性率高达25%,占阳性样品总数的50%,这可能与饲料中添加铬制剂有关。

3　结论

本研究采用分子交联技术成功合成免疫原Cr3+-iEDTA-BSA,应用细胞融合技术制备出稳定性好、亲和力高、特异性强的Cr3+-EDTA mAb,其Ka为2.69×109L/mol,对Cr3+-EDTA的IC50为9.84 μg/L,与其他化合物无交叉反应性。采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金,颗粒大小均一,分布均匀,粒径为25 nm,胶体金标记抗体最佳标记浓度为7.0 μg/mL。采用GICA技术模式,成功研制出Cr-Strip,检测时间为10 min,检测限为5 μg/L,可满足国际规定的50 μg/L的安全限值。通过实际样品检测和初步应用,并用ICP-AES对Cr-Strip进行验证,Cr-Strip的敏感性与ICP-AES相当,两种方法得到的检测结果一致,符合率为100%。本实验所研制的Cr-Strip特异性、稳定性和敏感性较好,操作快速简便,适用于现场大批量样品的快速筛检,为食品质量监管提供了重要的工具。

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Preparation of monoclonal antibody against trivalent chromic ion and development of colloidal gold immunochromatographic assay for detecting total chromium content in food

WANG Ya-nan1,WANG Xiao-fei2,DING Han1,ZHANG Hai-tang1,FAN Guo-ying1,WANG Zi-liang1,*

(1.School of Animal Science,Henan Institute of Science and Technology,Xinxiang 453003,China;2.School of Xinke,Henan Institute of Science and Technology,Xinxiang 453003,China)

Object:To prepare monoclonal antibody against Cr3+chelate EDTA complex(Cr3+-EDTA mAb)and develop colloidal gold immunochromatographic assay for detecting total chromium content in food(Cr-Strip). Method:The isothiocyanate method was employed to synthesize Cr3+-iEDTA-BSA,which was identified by UV and ICP-AES. The hybridoma lines that secrete Cr3+-EDTA mAb were established by cell fusion and Cr3+-EDTA mAb were induced frominvivomethod and their immunological properties were analyzed. Based on Cr3+-EDTA mAb,Cr-Strip was developed and its traits were verified. Results:Three hybridoma lines were screened out and the best one was 2A11G5. The Kaof Cr3+-EDTA mAb was 2.69×109L/mol and its IC50against Cr3+-EDTA was 9.84 μg/L and it had little or no cross-reactivity with other metal ion. The Cr-Strip could be accomplished qualitative detection of Cr3+-EDTA in 10 minutes,and its detection limit was 5 μg/L,its coincidence rate was 100% compared with ICP-AES. Conclusion:The high quality Cr3+-EDTA mAb had been generated and the Cr-Strip which was more sensitive had been developed successfully.

Cr3+;immunogen;monoclonal antibody;colloidal gold immunochromatographic assay;total chromium

2016-04-11

王亚楠(1989-),女,硕士研究生,研究方向：食品安全免疫检测,E-mail:792176339@qq.com。

王自良(1966-),男,博士,教授,研究方向：免疫学与抗体工程,E-mail:wangziliang66@126.com。

“十二五”国家科技支撑计划项目(2011BAK10B01);“十二五”国家科技支撑计划项目(2014BAD13B05)。

TS207.3

A

1002-0306(2016)18-0063-07

10.13386/j.issn1002-0306.2016.18.004