豌豆组织培养及遗传转化研究进展

张丽娟， 杨晓明， 王 昶， 陆建英， 闵庚梅

(甘肃省农业科学院 作物研究所, 兰州 730070)



豌豆组织培养及遗传转化研究进展

张丽娟， 杨晓明， 王 昶， 陆建英， 闵庚梅

(甘肃省农业科学院 作物研究所, 兰州 730070)

对近年来国内外豌豆组织培养和遗传转化方面的研究进行了综合性概述。介绍了豌豆组织培养过程中基因型、外植体、基础培养基、外源激素等方面的研究成果，重点综述了不同激素种类、浓度及其激素的不同组合对豌豆愈伤组织诱导和根芽分化的影响，同时总结了豌豆转基因方面的研究进展，并对豌豆遗传转化的主要问题和今后的研究方向进行探讨和展望。

豌豆；组织培养；遗传转化；基因型

豌豆(PisumsativumL.)具有较全面而均衡的营养，易于消化吸收，兼作蔬菜饲料，可作为世界范围内人类和动物营养来源之一[1]。近年来，豌豆在食用、深加工和畜牧饲料方面发展迅猛，中国已成为世界上生产干豌豆的第二大国和生产青豌豆的第一大国[2]。但是病虫害和非生物胁迫等因素严重影响豌豆的品质和产量[3]。利用组织培养的方法进行豌豆快速繁殖、品种改良、基因工程育种、种质纯化与保存及次生代谢产物生产等越来越为人们所关注。传统育种手段进行豌豆改良受限于豌豆自然变异有限,转基因技术巨大的潜能可以实现这一目标。豌豆组织培养及再生研究作为遗传转化的基础成为研究的重点。本文就多年来国内外有关豌豆组织培养技术及遗传转化研究进展进行概述，以期对今后豌豆育种研究有所裨益。

1　豌豆组织培养研究进展

近年来，对豌豆的研究主要集中在通过再生体系和遗传转化进行转基因豌豆生产，组织培养技术和转基因技术也用于其他豆类植物，相比其他许多作物更具优势。一个高效的再生体系作为通过基因工程手段导入外源基因进行品种选育的研究基础。这个再生系统必须快速、可靠、适用于多种基因型。

早在20世纪70年代，Malmberg等[4]就开始了豌豆组织培养的研究。先后有通过原生质体和一系列外植体进行豌豆不定芽再生和体细胞胚胎发生的报道。但豆科植物再生较为困难，豌豆再生的研究由于基因型决定、再生频率低、可重复性差等原因进展缓慢。国内外众多学者进行豌豆组织培养研究多通过体细胞胚胎发生和器官发生两个途径进行，在豌豆组织培养的关键影响因素如基因型、外植体选择、培养基类型和外源激素等研究中取得一些成果。

1.1基因型的影响

豌豆的再生途径主要有体细胞胚胎发生途径和器官发生途径两种：1)体细胞胚胎发生途径是指体细胞在特定条件下，未经性细胞融合而通过与合子胚胎发生类似的途径发育出新个体的形态发生过程。外植体通过培养分化出胚状体而发育成再生植株的过程。2)器官发生途径是由外植体直接或间接通过愈伤组织阶段，诱导出不定芽或不定根原的器官发生，包括从愈伤组织或悬浮培养的细胞和原生质体再生植株。在豌豆组织培养研究过程中发现，基因型对豌豆再生的影响很大。有关基因型影响的豌豆体细胞胚胎发生和器官发生再生途径均有报道。不同基因型体细胞胚胎发生效率不同。在对6个不同波兰豌豆品种进行再生研究发现不同品种的胚胎发生能力不同，只有3个品种形成胚状体。其中Heiga外植体有43%响应，而Cud Ameryki只有6%[5]。Loiseau等[6]同样研究发现不同豌豆品种体细胞胚胎发生能力存在差异。采用生长两周的海边香豌豆[Lathyrusmaritimus(L.) Bigel]无菌苗可诱导形成大量球形胚和心形胚以及极少量鱼雷胚和子叶胚[7]。Tzitzikas等[8]以4个豌豆品种(Espace,Classic, Solara and Puget)进行植株再生的研究，结果表明4个品种体细胞胚胎发生均能再生成完整植株且是由基因型所决定。Sánchez等[9]采用豌豆品种Santa Isabel不同外植体进行再生研究并获得再生植株。 采用不同基因型保加利亚豌豆品种进行再生研究，发现器官发生过程中其响应存在差异[10]。以豌豆品种Espace为材料进行器官发生的研究，再生频率高达100%[11]。苏承刚等[12]采用食荚型豌豆1号进行植株再生的研究，诱导的再生植株移栽成活率达85%左右。研究认为不同基因型豌豆品种Terese, Solara, Frisson and P64 (Frisson的变种) 诱导枝芽发生或体细胞胚胎发生与基因型有关，考虑体细胞胚胎发生可能是多细胞起源，故认为枝芽发生的再生途径比体细胞胚胎发生途径更为可行，少数外植体可不受基因型影响进行体细胞胚胎发生[13]。几个波兰豌豆栽培种诱导的再生植株移栽成活可提高豌豆再生率并用于农杆菌介导的遗传转化[14]。而Das等[3]最新研究结果显示6个独立基因型的印度紫花豌豆品种均可诱导大量不定芽进行再生，再生苗成功移栽温室发育成熟，故认为这种豌豆再生的方法不受基因型限制。

1.2外植体的选择

根据植物细胞全能性，理论上任何活组织在适宜的条件下都能发育成完整的植株。但是，不同生长状况、发育阶段、生长环境和不同的外植体存在一定的生理生化差异，因此选择不同外植体可影响组织培养的形态发生。通过未成熟子叶[15]、子叶节[16]、胚轴[7]、胚[9]、愈伤组织[17]、成熟种子[11]、子叶[14]及原生质体[19]等进行豌豆不定芽再生和体细胞胚胎发生已有报道。但植株再生体系的研究进展缓慢且再生频率低。一个外植体单个细胞进行稳定的遗传转化几率很低，因此一个主要目的是筛选出可形成丰富芽原基或体细胞胚的豌豆外植体，豌豆未成熟子叶被证明可作为最佳外植体。通过豌豆未成熟子叶诱导不定芽再生和体细胞胚胎发生是个简便有效的豌豆再生方法。Griga等[15]以未成熟子叶为外植体，利用器官发生和体细胞胚胎发生进行豌豆组织培养的研究。器官发生还多通过豌豆子叶节和胚轴诱导不定芽从而建立豌豆再生体系。以紫花豌豆未成熟子叶节和胚轴为外植体进行试管内再生，可诱导大量不定芽形成完整植株[3]。分离单个豌豆胚轴愈伤组织诱导产生不定芽，不定芽嫁接到年轻的豌豆幼苗可再生成健壮植株[17]。以10个保加利亚豌豆品种胚轴为外植体进行愈伤组织和不定芽诱导，均具有高再生率(50%～100%)[10]。王江波[7]采用下胚轴为外植体诱导胚性愈伤组织。以下胚轴节段为外植体通过生长调节剂可诱导产生大量不定芽并正常生根，获得再生植株并正常开花结籽[13]。利用具有分生能力的带节茎段诱导形成大量不定芽，进而再生成完整植株[8]。苏承刚等[12]以叶、茎、真叶为材料进行外植体筛选及组织培养研究，试验结果表明豌豆带节茎段是最佳试验材料。杨柯[20]发现茎段最易诱导形成愈伤组织，其细胞胚性较强，有利于细胞分裂和分化。以埃及豌豆栽培种下胚轴、叶片、根和成熟胚为外植体进行愈伤组织诱导，其中下胚轴是愈伤增殖最佳外植体；下胚轴、叶片和未成熟子叶可作为不定芽器官发生的最佳外植体[21]。近子叶端的胚轴具有较高再生能力，然而，胚轴的存在抑制不定芽再生[22]。另外，Pniewski等[14]以子叶为外植体诱导形成的愈伤组织均可再生不定芽。SHAN等[18]用豌豆种子直接进行丛生芽诱导，器官再生频率高达100%。Sánchez等[9]利用豌豆鲜籽粒合子胚进行再生研究。

不同的外植体器官分化能力不同，故认为外植体是影响豌豆器官分化频率的因素之一。未成熟胚和芽尖组织作为常用外植体不仅可进行器官发生，也可作为体细胞胚胎发生的外植体。而Tzitzikas等[8]认为由胚直接再生的概率较低。以不同来源29个豌豆品种茎尖，未成熟子叶和胚轴为外植体进行体细胞胚胎发生的研究，茎尖、未成熟子叶可产生胚状体，而胚轴胚胎发育不良。利用形态学和解剖学分析形成体细胞胚与外植体有关[6]。

1.3培养基的影响

植物组织诱导和分化培养在很大程度上取决于对培养基的选择。不同培养基有不同特点，适合于不同的植物种类和接种材料。豌豆组织培养最常用的基本培养基为MS和1/2MS培养基，也有用B5培养基的[10]，还有使用MB5培养基即1/2MS的大量元素加上B5培养基的维生素。除此之外，使用其他培养基进行豌豆组织培养还未见相关报道。MB5培养基多用于愈伤组织诱导。Griga等[15]采用MB5培养基进行愈伤组织诱导,进而诱导胚胎发生。Madsen等[23]研究发现由薄层细胞(TCLn)诱导不定芽再生的植株仍旧是二倍体(2n=14)。说明薄层细胞(TCLn)产生的不定芽诱导根的分化主要是受不定芽再生培养基的影响而不是生根培养基的影响。这个结论意味着再生培养基具有相当长并持久的影响。除培养基本身，其他添加物也会对豌豆组织培养产生不同影响。碳源作为培养基不可或缺的成分，在对29个不同豌豆品种进行体细胞胚胎发生的研究中发现，当果糖代替蔗糖时，有22个品种茎尖可产生更多的胚状体。当麦芽糖代替蔗糖时，由未成熟子叶为外植体进行体细胞胚胎发生的品种由20个增至29个。因此，碳源在豌豆体细胞胚胎发生中起重要作用[6]。Madsen等[23]认为1.5%或3.0%的葡萄糖或蔗糖对诱导芽再生和分化根的能力没有太大影响。在芽分化培养基中添加硝酸银可减少玻璃化，但同时大大降低生根率。Ozcan等[22]认为附加AgNO3不能提高不定芽的增殖数量但能促进不定芽形成发达的卷须和大的托叶以提高其支持能力。王江波[7]认为NaCl对于胚性愈伤组织的诱导十分关键。

1.4外源激素植物生长调节物

不同的再生途径和诱导目标，使用的激素种类和配比也有所不同。调节外源生长素与细胞分裂素的含量和比例，或分阶段使用不同激素添加物不仅能诱导细胞分裂和生长，还能控制细胞分化与形态建成[24]。

1.4.1愈伤组织诱导

愈伤组织诱导中常用的激素有NAA、2,4-D和BA。Ozcan等[22]通过MS培养基附加0.5 mg/L 6-BA和4 mg/LNAA可诱导愈伤组织。在附加2 mg/L 2,4-D和1 mg/Lkin(激动素)的MB5培养基上也可诱导愈伤组织[21]。Kosturkova等[10]则认为只附加0.2 mM 2,4-D或5 mM BA即可诱导愈伤组织。将生长两周的海边香豌豆[Lathyrusmaritimus(L.)Bigel]无菌苗下胚轴培养于含有1 mg/L 2,4-D,0.5 mg/L 6-BA和0.5%NaCl的MS培养基中，4周后将诱导出胚性愈伤组织。研究表明诱导体细胞胚适宜的2,4-D浓度为0.5 mg/L。较高浓度的2,4-D虽会阻止体细胞胚越过球形期发育,但有利于体细胞胚产生率的提高。体细胞胚发生的频率会随胚性愈伤组织开始的几次继代降低，以后逐渐趋于稳定[7]。未成熟合子胚在附加2.26 mM 2,4-D的培养基中可诱导产生胚性愈伤组织[25]。而Sánchez[9]认为合子胚在附加1至2.5 mg/L BAP的光照条件下诱导培养效果最佳。苏承刚等[12]研究结果表明，在附加1 mg/L 6-BA和1 mg/L NAA的MS培养基中，愈伤组织诱导率可达100%。但通过愈伤组织途径再生的植株比直接再生植株发生体细胞突变的概率大很多。

1.4.2诱导不定芽

不定芽主要起源于胚轴的表皮和皮层细胞，为外起源，形成的不定芽结构与正常芽相同。豌豆遗传转化多采用不定芽再生途径。一般在培养基中添加较高浓度的细胞分裂素(如BA、KT、TDZ)和较低浓度的生长素类物质(如NAA、2,4-D、IBA)能促进侧芽萌发和不定芽的产生。豌豆子叶节在附加1 mg/L BAP的MS培养基可诱导不定芽产生。通过刮擦节点处或提高细胞分裂素浓度增加不定芽的数量。大于5 mg/L的细胞分裂素会增加不定芽的数量但易玻璃化和不生根[17]。2 mg/L BA+1 mg/L NAA的MS培养基是诱导不定芽的最佳培养基，未成熟子叶附加1 mg/L BA可进行不定芽高频增殖[21]。胚轴在附加10 mM BA和1 mM NAA的培养基可直接形成不定芽[10]。愈伤组织在附加4.5 mg/L BAP的MB5培养基可再生数个不定芽[14]。带节茎段在附加2～3 mg/L BA和0.1 mg/L NAA的MS培养基中,腋芽和丛生芽产生率达100%,芽增殖系数在3以上[12]。附加1.0 mg/L BAP和0.2 mg/L NAA每个外植体可形成22.34个芽, 附加2.0 mg/L BAP和0.4 mg/L NAA出芽率最高可达(67.55±4.74)%[3]。

TDZ作为一种新兴的外源激素已被广泛用于体细胞胚胎发生和不定芽诱导。显示出细胞分裂素作用的功能特点，可抑制顶端分生组织生长而促进侧生分生组织形成不定芽。在培养基中加入TDZ可以使体细胞胚胎在完整豌豆、花生和鹰嘴豆幼苗不同部位产生，而嘌呤型细胞分裂素BA(N6-苄基腺嘌呤)只能使芽再生，TDZ较BA具有更强的诱导分生能力，这表明TDZ诱导的体细胞胚胎发生反应是完全不同于细胞分裂素[26]。

在豌豆组织培养中，利用TDZ进行豌豆不定芽诱导已得到广泛应用。有研究表明豌豆种子在只附加TDZ的培养基中可诱导形成大量不定芽。TDZ浓度和培养时间影响丛生芽的数量及不定芽成苗。添加TDZ豌豆可形成水样组织同时产生不定芽。豌豆种子在附加4 mg/L TDZ的MS培养基中培养12周后，每粒种子产生的丛生枝数量可达到200多个[11]。带有一个节点约(1cm size)的茎段在附加TDZ的培养基中进行培养，产生大量形态正常且膨大的不定芽，经继代形成膨大的水渍状含芽组织，进而形成不定芽。研究表明从多重芽上隔离单个芽可再生成完整植株[8]。TDZ浓度为10μM时愈伤组织的芽分化率最佳。不定芽在附加腺嘌呤(N-isopentenyl adenine)和吲哚丁酸(IBA)的培养基中生殖生长。但由TDZ诱导的不定芽几乎不生根[17]。

1.4.3根的分化

一般来讲，低浓度的生长素(如NAA、IBA、IAA)即可诱导生根。不定芽在附加1 mg/L IBA的1/2MS培养基中易生根，进而可进行移栽[22]。Ghanem等[21]认为最佳生根培养基是1/2MS附加40 g/L蔗糖和2 mg/L NAA。Tzitzikas等[8]认为分别附加0.5 mg/L NAA、IAA 或IBA的生根培养基均可诱导生根。不定芽在附加3 mg/L NAA的MS培养基上生根率可达86%；试管苗移栽成活率85%左右[12]。Shan等[18]发现不定芽在附加2～3 mg/L IAA和2 mg/L NAA的MS培养基中可高频生根。Das等[3]认为不定芽在分别附加不同生长素IBA、IAA、NAA的1/2MS培养基均可诱导生根，且结果相似。由于前期培养目的不同，所使用的培养基、激素种类及浓度会对诱导生根产生影响。但有研究发现BCT在附加TDZ的培养基上继代超过2年再生芽形成根的能力下降。过量的TDZ抑制根芽的分化[26]。Madsen等[23]研究发现豌豆长期培养在附加TDZ或BAP的培养基中会抑制芽分化根的能力。培养过程中细胞分裂素的添加使得细胞内源细胞分裂素水平升高直接影响后期生根困难[27]。Pniewski等[14]认为在附加0.02 mg/L BAP的培养基中进行不定芽预培养有益于诱导生根或移栽，在附加1.0 mg/L NAA的生根培养基中生根率大大提高。TDZ可促进乙烯产生，不利于苗生根，将TDZ诱导的苗转移到含生长素的培养基中才可能生根[28]。附加乙烯抑制剂AgNO3可促进根的形成，适宜的AgNO3浓度可以增加根长、根数和促进根的生长[29]。

2　豌豆遗传转化研究进展

植物遗传转化(genetic transformation)是指以离体培养的植物组织、细胞或原生质体作为受体，通过某种技术途径将人工分离和修饰过的外源基因导入植物基因组中使得外源基因能够稳定地表达，获得的转基因植物由于导入基因的表达而引起可遗传性状修饰的技术。基因工程可以改良常规育种难以改造的性状如品质、抗虫性、抗病性、抗旱性和产量等。基因修饰成功与否取决于转化细胞是否具有独立再生能力并与所转基因相融合，通常是通过耦合有抗生素抗性或抗除草剂的基因来实现。适宜的抗生素或除草剂添加到培养基中从而区分转化细胞。豌豆作为重要的豆类作物，起初认为不能进行基因转化，有关豌豆遗传转化的研究国内外报道并不多。

2.1转化方法的研究

植物遗传转化的方法有很多种，如农杆菌介导法、基因枪法、花粉管通道法、茎尖转化法、PEG法、电穿孔法等。目前用于豌豆遗传转化的方法主要是农杆菌转化法。

农杆菌转化法是以农杆菌为中间介体，质粒编码的VIR蛋白将经过或未经过改造的T-DNA导入植物细胞中，进而转化植物细胞。用于遗传转化的农杆菌有根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)和发根农杆菌(Agrobacteriumrhizogenes)2种，分别携带Ti质粒和Ri质粒，可诱导产生冠状瘤和毛状根。农杆菌转化法是植物基因工程中应用最多、效果最理想的方法。

2.2农杆菌菌株

农杆菌菌株自身因素对其侵染能力有很大影响，不同菌株，不同培养条件侵染能力存在差异。在豌豆遗传转化中多采用根癌农杆菌，使用较多的有农杆菌菌株LBA4404、EHA101和C58。采用根癌农杆菌C58 和ACH5，野生型发根农杆菌9402转化豌豆不同组织的研究中发现，只有经C58和9402转化的外植体可分别形成根瘤和发状根[30]。Nadolska等比较了LBA4404，C58C1和EHA105 3种菌株对豌豆的转化效率，其中LBA4404每转化100株获得1株转基因植株，C58C1菌株获得2.2株，EHA105菌株获得8.2株，认为EHA105的转化效率最强[31]。植物遗传转化的研究中，农杆菌LBA4404菌株广谱性好, 对多种植物均有较好侵染力，且易于保存繁殖，常作为遗传转化的首选菌株。

2.3外源基因种类

在豌豆遗传转化的研究中，转移的多数为筛选标记GUS和NPTII。新霉素磷酸转移酶基因(nptII)是豌豆转化研究中最常使用的标记基因。潮霉素磷酸转移酶基因(hpt)和抗除草剂基因(bar)等选择标记基因在豌豆遗传转化中也有使用。根据转化时质粒上所携带的标记基因，选择一定的抗生素进行筛选，使转化体与未转化体进行区分。另外，利用农杆菌介导法将目的性状改良的基因导入豌豆的研究也将逐步开展。

Jordan等[16]构建含有nos、gus和nptII的双元载体，通过根癌农杆菌进行转化，转化外植体在卡那霉素选择培养基上培养21 d后进行观察，可获得转基因单株。但其后代中插入基因在表达时发生分离，说明所转基因的遗传和表达至少经历2代。构建含有pIBGUS、一个内含子、35S-启动子gusA和2个选择标记基因的双元质粒，通过高毒性农杆菌EHA101介导豌豆组织细胞的遗传转化，农杆菌侵染后4 d，根据GUS的活动情况进行检测，gusA瞬间表达[32]。Nadolska等采用含有nptII、hpt、dhfr或bar中任一基因的双元载体pGPTV，通过农杆菌EHA105菌株进行遗传转化，经PCR和Southern杂交检测T-DNA稳定转入下一代[31]。Petra构建含有报告基因uidA和选择标记基因bar的表达载体，通过根癌农杆菌转化豌豆外植体，经抗性选择获得uidA表达的再生芽。最后转化株生根并成功移栽[33]。王秀峰[34]首次利用基于豌豆早褐病毒(PEBV)的pCAPE1和pCAPE2-GFP表达载体，建立豌豆瞬时表达体系，抗人酸性成纤维细胞生长因子(acidicfibroblastgrowthfactor,aFGF)的单链抗体在豌豆中瞬时表达。

2.4转化受体的研究

转化效率的高低除了转化方法本身特点的影响外，还与受体系统自身的生物因素有关。不同植物、同一植物不同器官或同一器官的不同发育阶段对于遗传转化成功与否具有重要意义。在许多作物中，抗性选择在如愈伤组织等一致的细胞中进行。作为受体系统要求具有良好的再生能力和充足的外植体来源。已报道的豌豆遗传转化研究中采用了多种受体系统材料，如豌豆子叶节[16], 胚轴[7]和未成熟子叶[15]等。Hussey[30]起初认为豌豆芽尖是最佳转化器官。而Kathen等[32]在探索豌豆组织细胞是否能进行农杆菌转化时发现，转化受体仅限于子叶和上胚轴去分化后的组织细胞。以子叶分生组织为外植体可重复进行根癌杆菌介导的遗传转化，子叶分生组织不经过愈伤组织阶段迅速产生转基因芽。这个转化系统更有利于缩短遗传转化再生周期[35]。含芽组织(BCT)的再生特性也有利于进行遗传转化。通过携带荧光素酶报告基因的根癌农杆菌(A.tumefaciens)转化BCT，获得荧光素酶基因表达的BCT，进而形成转基因植株。通过诱导不定芽建立豌豆再生体系从而获得转基因植株，这个方法的缺点是再生芽的选择效率低，转化植株畸变率高。很大可能是分生组织复杂的多细胞结构使得单个细胞独立划分困难[8]。 认为以豌豆成熟种胚截段为受体材料进行农杆菌转化最为高效，再生芽中GUS瞬间表达。

3　展望

虽然豌豆的组织培养和遗传转化取得了一定进展，但目前建立的方法不能够广泛适用于大多数豌豆品种。豌豆遗传转化主要问题是转化率低，外源基因表达强度不够，原因可能是转化细胞的存活率低，稳定性差。进一步研究影响豌豆再生及遗传转化的因素，提高再生率及转化率。加大转导基因的稳定表达以及稳定传递于后代的相关研究，将国外已发现的与抗病基因紧密连锁的分子标记尽快应用于育种实践，使农杆菌介导的豌豆转基因体系在育种工作中发挥越来越重要的作用，不失为一种好的育种策略。

[1]GEPTS P, BEAVIS W D, BRUMMER E C, et al. Legumes as a model plant family: genomics for food and feed. Report of the Crosslegume Advances through Genomics(ACTG)Conference[J]. Plant Physiology, 2005, 137(4):1228-1235.

[2]贺晨帮, 宗绪晓. 豌豆种质资源形态标记遗传多样性分析[J].植物遗传资源学报, 2011, 12(1): 42-48.

[3]DAS A, KUMAR S, NANDEESHA P, et al. An efficient in vitro regeneration system of fieldpea(PisumsativumL.) via. shoot organogenesis[J]. Journal of Plant Biochemistry and Biotechnology, 2014, 23(2):184-189.

[4]MALMBERG R L. Regeneration of whole plants from callus culture of diverse genetic lines ofPisumsativumL.[J]. Planta, 1979, 146(2):243-244.

[5]NADOLSKA O A, MILKOWSKA L, ORCZYK W. Two ways of plant regeneration from immature cotyledons of pea[J]. Acta Societatis Botanicorum Poloniae, 1994, 63(2): 153-157.

[6]LOISEAU J, MARCHE C, DEUNFF Y L. Variability of somatic embryogenic ability in the genusPisumL: effects of genotype, explant source and culture medium[J]. Agronomie, 1996, 16(5):299-308.

[7]王江波. 海边香豌豆组织培养和遗传转化的研究[D]. 兰州:兰州大学, 1999.

[8]TZITZIKAS E N, BERGERVOET M, RAEMAKERS K, et al. Regeneration of Pea (PisumsativumL.)by a cyclic organogenic system[J]. Plant Cell Reports, 2004, 23(7):453-460.

[10]KOSTURKOVA G, MEHANDJIEV A, DOBREVA I, et al. Regeneration systems from immature embryos of Bulgarian pea genotypes[J]. Plant Cell Tissue and Organ Culture, 1997, 48(2):139-142.

[11]单志慧. 豆科作物高效器官再生体系的建立及其在遗传转化中的应用[D]. 南京:南京农业大学, 2005.

[12]苏承刚, 吴学科, 郑占伟, 等. 食荚型豌豆组织培养和植株再生研究[J]. 西南师范大学学报(自然科学版), 2007, 32(4):30-32.

[13]OCHATT S J, PONT CAILLE C, RANCILLAC M. The growth regulators used for bud regeneration and shoot rooting affect the competence for flowering and seed set in regenerated plants of protein peas[J]. In Vitro Cellular & Developmental Biology-Plant, 2000, 36(3):188-193.

[14]PNIEWSKI T, WACHOWIAK J, KAPUSTA J, et al. Organogenesis and long-term micropropagatlon of Polish pea cultivars[J]. Acta Societatis Botanicorum Poloniae, 2003, 72(4):295-302.

[15]GRIGA M, STEJSKAL J, BEBER K. Analysis of tissue culture-derived variation in Pea (PisumSativumL.)-Preliminary results[J]. Euphytica, 1995, 85(1):335-339.

[16]JORDAN M C, HOBBS S. Evaluation of a cotyledonary node regeneration system for Agrobacterium-mediated transformation of pea (PisumsativumL.) [J].In Vitro Cellular & Developmental Biology-Plant, 1993, 29(2):77-82.

[17]BÖHMER P, MEYER B, JACOBSEN H J. Thidiazuron-induced high frequency of shoot induction and plant regeneration in protoplast derived pea callus[J]. Plant Cell Reports, 1995, 15(1): 26-29.

[18]SHAN Z H, TZITZIKAS E N, RAEMAKERS K, et al. Effect of TDZ on plant regeneration from mature seeds in pea (Pisumsativum) [J]. In Vitro Cellular & Developmental Biology—Plant, 2009, 45(6):776-782.

[19]BOHMER P, 冯钦华. TDZ诱导的豌豆原生质体再生系统[J].国外农学-杂粮作物, 1997(2):28-29.

[20]杨 柯. 豌豆离体再生体系的建立及其NO提高豌豆幼苗耐盐性的生理机制研究[D]. 甘肃：甘肃农业大学, 2013.

[21]GHANEM S A, EI-BAHR M K, SAKER M M, et al. In vitro studies on Pea (PisumsativumL.): I. Callus formation, regeneration and rooting[J]. Giornale Botanico Italiano, 1996, 130:695-705.

[22]OZCAN S, BARGHCHI M, FIREK S, et al. High frequency adventitious shoot regeneration from immature cotyledons of pea (PisumsativumL.) [J]. Giornale Botanico Italiano,1992,11(1):44-47.

[23]MADSEN M H, NAUERBY B, FREDERIKSEN C G, et al. Regeneration of Pea (PisumSativumL.)by the thin cell layer nodal system:influence of explant culture media on rooting and plantlet formation [J]. Acta Agriculturae Scandinavica, 1998, 48(1):58-64.

[24]崔凯荣，邢更生，周功克，等．植物激素对体细胞胚胎发生的诱导与调节[J]．遗传，2000，22(5):349-354.

[25]GRIGA M. Morphological alterations in sterile mutant ofPisumsativumobtained via somatic embryogenesis[J]. Biologia Plantarun, 2000, 43(2):161-165.

[26]MURTHY B N S，MURCH S J，SAXENA P K．Thidiazuron： a potent regulator of in vitro plant morphogenesis[J]. In Vitro Cellular and Developmental Biology, 1998, 34(4): 267-275.

[28]PÉREZ-TORNERO O，BURGOS L. Adventitious shoot regeneration from in vitro cultured leaves of apricot[J].Acta Horticulturae, 2000, 538: 659-662.

[29]KHALAFALLA M M, HATTORI K. Ethylene inhibitors enhance in vitro root formation on faba bean shoots regenerated on medium containing thidiazuron [J]. Plant Growth Regulation, 2000, 32(1): 59-63.

[30]HUSSEY G, JOHNSON R D, WARREN S. Transformation of meristematic cells in the shoot apex of cultured pea shoots by Agrobacterium tumefaciens and A. Rhizogenes[J]. Protoplasma, 1989, 148(2):101-105.

[31]NADOLSKA O A, ORCZYK W. Study of the factors influencing Agrobacterium-mediated transformation of pea (PisumsativumL.) [J]. , 2000, 6(2):185-194.

[32]KATHEN A D, JACOBSEN H J. Cell competence for agrobacterium-mediated DNA transfer inPisumSativumL. [J]. Transgenic Research, 1995, 4(3):184-191.

[33]Petra K, Petra M, Pavel H, et al. The transformation of pea (PisumsativumL.): applicable methods of Agrobacterium tumefaciens-mediated gene transfer[J]. Acta Physiologiae Plantarum,2007,29(2):157-163.

[34]王秀峰.利用烟草和豌豆瞬时表达抗aFGF单链抗体[D]. 长春:东北师范大学,2015.

[35]BEAN S J, GOODING P S, MULLINEAUX P M, et al. A simple system for pea transformation[J]. Plant Cell Reports, 1997, 16(8): 513-519.

Advances in tissue culture and genetic transformation of pea

ZHANG Li-juan,YANG Xiao-ming, WANG Chang， LU Jian-ying, MIN Geng-mei

( Institute of Crop, Gansu Academy of Agricultural Sciences, Lanzhou 730070, China)

This paper reviewed new development on tissue culture and genetic transformation of pea at home and abroad in recent years. It described research achievements on genotypes, explants, basic medium, exogenous hormones in the process of tissue culture, etc, and summarized emphasisly the effects of different types, concentration and combinations of hormone on callus induction, root and buds differentiation in pea. At the same time, the paper summarized research progress on genetic transformation of pea, and finally discussed and prospected the main problems and future research directions of genetic transformation in pea.

pea; tissue culture; genetic transformation; genotype

2015-12-22；

2016-02-01

国家自然科学基金(31160304)；现代农业食用豆产业技术体系(CARS-09-G8)；兰州市农业科技攻关项目(2015-3-54)

张丽娟，硕士研究生，研究方向为食用豆遗传育种及病虫害防控，E-mail:binglingbeer103@163.com

杨晓明，研究员，主要从事豌豆育种及病虫害防治工作，E-mail：yangxm04@hotmail.com

S643.3

A

2095-1736(2016)05-0094-06

doi∶10.3969/j.issn.2095-1736.2016.05.094