基于牛分枝杆菌PPD的猕猴全血IFN-γ释放试验观察

闵凡贵，郭 羽，罗 挺，潘金春，刘助红，黄树武，张 钰

(1. 广东省实验动物监测所，广东省实验动物重点实验室，广东广州 510663；2. 北京天坛生物制品股份有限公司，北京 100176)



基于牛分枝杆菌PPD的猕猴全血IFN-γ释放试验观察

闵凡贵1，郭 羽2，罗 挺1，潘金春1，刘助红1，黄树武1，张 钰1

(1. 广东省实验动物监测所，广东省实验动物重点实验室，广东广州 510663；2. 北京天坛生物制品股份有限公司，北京 100176)

目的 分析全血IFN-γ释放试验在猕猴分枝杆菌检测中的应用价值。方法 首先测定结核菌素试验(TST)阳性、阴性猕猴血清样本的基础IFN-γ含量。然后以PBS为对照，200 IU bovine-PPD为刺激抗原，分别与TST阴性和阳性猕猴肝素抗凝血共培养约24 h，收集血浆，测定IFN-γ含量。通过分析抗原刺激前后血浆IFN-γ含量变化和刺激指数探讨全血IFN-γ释放试验的诊断效能。结果 TST阳性猕猴血清基础IFN-γ含量明显高于TST阴性猕猴，但离散度都较大。PPD刺激前后，TST阴性猕猴血浆IFN-γ含量无明显变化，而TST阳性猕猴血浆IFN-γ含量明显升高(P<0.01)。刺激指数结果显示，TST阳性猕猴明显高于TST阴性猴(P<0.01)。ROC曲线分析表明，血浆IFN-γ含量和刺激指数均可作为全血IFN-γ释放试验的评价指标。结论 本研究基于小样本量的实验结果证实，全血IFN-γ释放试验是猕猴分枝杆菌快速诊断的有益补充方法。

猕猴，全血IFN-γ释放试验，PPD，分枝杆菌

猕猴是目前用量最大的实验非人灵长类动物，已实现了人工规模化和标准化的生产繁育。然而，猕猴的生产繁育却长期遭受到多种病原的威胁，其中，分枝杆菌病对猕猴饲养的影响巨大，以结核分枝杆菌病最为严重，由于其病原具有强烈的人兽共患性，并且群内传播和种间传播速度快，传播途径多样，控制其传播显得尤为重要，而早期筛查与及时隔离感染猴为当前最有效的控制手段[1]。

目前，实验猴结核诊断的金标方法是结核菌素试验(tuberculin skin test，TST)，其次是病原学诊断，病理学(活体病理学)诊断应用相对较少。血清学诊断和分子生物学诊断方法也被用于猕猴结核诊断中，但多数仍处于研究阶段[2-4]。鉴于目前常用的诊断方法缺乏足够的准确性以及不能实现快速诊断，本研究将探讨全血IFN-γ释放试验的可行性。全血IFN-γ释放试验是基于外周血单核细胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)对分支杆菌抗原刺激的记忆功能而实现的，体外抗原刺激活化的PBMC可诱导产生IFN-γ，通过测定血浆IFN-γ的增量来初步判断机体是否感染病原。在医学领域，全血IFN-γ释放试验被证实具有快速、简便等特点，降低了成本要求，成为较好的辅助诊断方法。如能将该技术充分用于实验猴的检测中，则有望大大提高结核病的诊断效能。

1 材料和方法

1.1 血清

近年来，在日常检疫和监督检测中收集到TST阳性猕猴血清30份，TST阴性猕猴血清70份。上述血清用于测定基础 IFN-γ含量。

1.2 抗凝血

广东某猕猴饲养场曾多次检出TST阳性病例，本研究收集到14例阳性猕猴肝素抗凝血，参照此前建立的方法进一步测定了PPD抗体[5-6]，结果全部为阳性(A450值为1.62±0.70，cutoff值为0.217)。 在其他猕猴饲养场采集TST阴性且PPD抗体阴性猕猴的肝素抗凝血37头份。上述抗凝血用于全血IFN-γ释放试验。

1.3 抗原

Bovituber-PPD，2 mL/瓶，源于Synbiotics Corp.，批号： Lot 142574。

1.4 全血PPD刺激培养

取24 h内的抗凝血2 mL，分别加入24孔细胞培养板孔内，1 mL/孔，每个样本2孔，然后依次加入0.1 mL PBS和0.1 mL PPD(200 IU)，置37℃、5% CO2培养箱孵育过夜，约24 h，收集血浆300 μL以上，-20℃保存。

1.5 血浆IFN-γ含量测定

通过流式细胞仪，采用luminex®液相芯片技术测定血浆中 IFN-γ含量，检测试剂盒源于默克密理博(Merck Millipore)。

1.6 统计学方法

测得的数据用Excel和SAS 8.01软件进行统计分析，分析方法包括随机、成对Student′sttest和ROC曲线分析等。

2 结果

2.1 血清基础IFN-γ含量

分别测定TST阴性和阳性猕猴血清样本的IFN-γ含量，检测结果见图1，分别为： 3.08±5.67 pg/mL(n=70，CV=184%)和31.88±85.46 pg/mL(n=30，CV=268%)。与TST阴性猕猴比较，TST阳性猕猴血清IFN-γ水平显著升高(unpairedt-test，P<0.01)。

图1 TST阳性和阴性实验猴血清IFN-γ含量Fig.1 Basic serum IFN-γ concentrations of TST-positive and -negative macaques

2.2 体外抗原刺激全血诱导IFN-γ产生情况

图2 PPD刺激前后血浆IFN-γ含量变化Fig.2 Changes in plasma IFN-γ pre- and post-stimulation by PPD

图3 PPD全血IFN-γ释放试验的刺激指数Fig.3 Stimulation indexes of PPD-based whole blood IFN-γ assay

以等体积PBS为阴性对照，分析PPD体外刺激全血诱导IFN-γ产生的情况，结果见图2。对于TST阴性猕猴，PPD刺激全血不会诱导PBMC产生IFN-γ，血浆IFN-γ含量不会显著升高(pairedt-test，P>0.05)；而对于TST阳性猕猴，PPD能显著刺激PBMC产生IFN-γ，血浆IFN-γ含量显著升高(pairedt-test，P<0.01)。

图4 ROC曲线分析Fig.4 Results of ROC curves analysis

2.3 刺激指数

鉴于TST阴性猕猴基础血清IFN-γ含量分布离散度较大，通过分析抗原刺激后的绝对IFN-γ含量来判定感染状态存在一定的风险。本研究进一步探讨了全血IFN-γ释放试验的刺激指数(stimulation index，SI)，即抗原刺激后和刺激前(PBS对照)血浆IFN-γ含量的比值。对TST阴性和阳性猕猴SI进行比较，结果显示，TST阳性猕猴SI明显高于TST阴性猕猴(unpairedt-test，P<0.01)。

2.4 ROC曲线分析

对TST阴性和阳性猕猴PPD刺激后血浆IFN-γ含量做ROC曲线分析，以阳性似然比最大时对应的IFN-γ含量为cutoff值，结果显示，最佳cutoff值为10.19 pg/mL，敏感性为100%，特异性为97.3%，ROC曲线下面积为0.9981(图4, A)。同样，对TST阴性和阳性猕猴的刺激指数做ROC曲线分析，显示最佳cutoff值为2.230，敏感性为100%，特异性为97.3%，ROC曲线下面积为1.0(图4, B)。以上述两种cutoff值判定，本研究选择的TST阳性猕猴均为分支杆菌感染。

3 讨论

IFN-γ体外释放试验包括全血IFN-γ释放试验和ELISPOT，与TST相比，具有敏感性和特异性高，不受TST操作上的主观因素的影响，结果更为客观可靠，检测快速，并且单次TST对IFN-γ检测对结果影响不大等优点，且该方法只需接触动物一次，有效减少了对动物的应激，具有很大的优越性；因此，IFN-γ体外释放实验被认为是TST理想的补充方法[7]。全血IFN-γ释放试验相比ELISPOT，进一步优化了试验程序，不需要分离PBMC，并且降低了对仪器和试剂的需求。

在结核病人全血IFN-γ检测方面已有商品化试剂盒(QuantiFERON-TB Gold)，并得到了美国FDA和欧盟CE Mark的双重认可；在牛方面，澳大利亚于1989年率先推出商品化检测试剂盒(BovigamTM)，此后被澳大利亚政府确认为根除牛结核计划的普检方法。尽管全血IFN-γ释放试验在人和牛结核检测中应用广泛，但是，其敏感性和特异性稳定性差，相关Meta分析的合并敏感性(低于80%)和特异性(低于75%)仅为中等水平[8-10]，尚不能替代TST成为结核诊断的金标准，可以成为TST的有益补充。全血IFN-γ释放试验在非人灵长类动物结核诊断方面应用不多，主要原因在于试剂盒用量小，而且非人灵长类动物IFN-γ与人和牛IFN-γ不同，具有种属特异性，导致试剂盒成本增高。国外现有的少量研究和病例报道显示，全血IFN-γ释放试验在诊断非人灵长类分枝杆菌感染方面具有较高的效能[11-13]；目前，国内仅有的1项初步应用报道只显示出中等的敏感性[14]。由此可见，全血IFN-γ释放试验在猕猴中的应用仍需进一步验证。我国是猕猴生产繁育大国，开展这方面研究具有重要的现实意义。

本研究首先分析了猕猴的血清基础IFN-γ水平，尽管TST阳性猕猴血清基础IFN-γ水平升高，但是离散度大，不足以成为诊断分枝杆菌感染的依据。然后，分析了PPD体外刺激对猕猴PBMC诱导产生IFN-γ的情况，结果表明，PPD刺激TST阴性猕猴不会诱导PBMC产生IFN-γ，血浆IFN-γ含量刺激前后无显著性变化；PPD刺激则可以诱导TST阳性猕猴PBMC产生大量的IFN-γ，导致血浆IFN-γ含量显著高于刺激前的测定值。进一步分析显示，PPD刺激后的IFN-γ绝对含量和SI均可作为判定分枝杆菌感染的依据，其中SI的准确性稍高(ROC曲线下面积比较)。本研究结果初步证实，全血IFN-γ释放试验是适于猕猴分枝杆菌感染诊断的有效补充手段，可以弥补TST的不足。

在刺激抗原用量方面，国外文献多数未提供PPD浓度，国内报道的PPD终浓度基本不超过20 μg/mL[15-16]。影响全血IFN-γ释放试验的因素很多，除了动物个体差异外，还包括PPD来源、用量、批次和生产厂家等[16]。本研究选择了Synbiotics Corp.生产的牛分枝杆菌PPD，纯度很高，预实验结果显示200 IU/孔和400 IU/孔无显著性差异，故选择200 IU/孔开展实验，相比国产PPD用量偏低。

本研究基于小样本量取得了较理想的实验结果，但仍处于初级研究阶段，尚需要大量临床样本来验证该方法的敏感性与特异性，尤其是TST检测假阴性样本的验证。

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Performance of bovine-PPD based whole blood IFN-γ assay for rhesus macaques

MIN Fan-gui1, GUO Yu2, LUO Ting1, PAN Jin-chun1, LIU Zhu-hong1, HUANG Shu-wu1, ZHANG Yu1

(1. Guangdong Laboratory Animals Monitoring Institute, Guangdong Provincial Key Laboratory of Laboratory Animals, Guangzhou 510663, China； 2. Beijing Tiantan Biological Product Co. Ltd., Beijing 100176)

Objective To assess the potential of whole blood IFN-γ assay for diagnosing mycobacterium in rhesus macaques. Methods Firstly, basic serum IFN-γ concentrations of TST-negative and -positive rhesus macaques were detected. Then, heparinized whole blood from TST-negative and -positive rhesus macaques was incubated with PBS and 200 IU bovine-PPD (tuberculin purified protein derivative) for about 24 h, respectively. The supernatant plasma were harvested and used to determine the concentrations of IFN-γ. The results of plasma IFN-γ concentrations and stimulation index (SI) were used to analyze the diagnostic potential of the whole blood IFN-γ assay. Results The basic serum concentrations of IFN-γ for the TST-positive monkeys were significantly higher than that of the TST-negative macaques, showing a high coefficient of variation. There was no significant effect on the production of IFN-γ in the TST-negative macaques. While significantly elevation of IFN-γ concentrations was found in stimulated plasma of TST-positive macaques (P<0.01). The SI of TST-positive macaques was significantly higher than the TST-negative ones. ROC curve analysis revealed that IFN-γ concentrations and SI could be used as evaluation index of whole blood IFN-γ assay. Conclusions Based on a small sample experiment we have demonstrated that whole blood IFN-γ assay may be one possible auxiliary diagnostic method for tuberculin skin test.

Rhesus macaques；Whole blood IFN-γ assay；Tuberculin purified protein derivative, PPD；Mycobacterium; Diagnosis

广东省科技计划项目(2013B020307005；2015A030302029;2016A030303023)；国家科技支撑计划(2013BAK11B01)。

闵凡贵(1980 - )，男，副研究员，硕士，研究方向： 实验动物与比较医学研究。

张钰(1970 - )，女，研究员，E-mail: zhangyugzh@hotmail.com。

R-33

A

1671-7856(2016)10-0005-04

10.3969.j.issn.1671-7856.2016.10.002

2016-03-19