高效液相色谱-电化学法测定人尿液中儿茶酚胺的浓度

陈 静，丘宏强（1.泉州医学高等专科学校药学系，福建泉州 36000；.福建医科大学附属协和医院药学部，福州 350001）

高效液相色谱-电化学法测定人尿液中儿茶酚胺的浓度

陈 静1＊，丘宏强2（1.泉州医学高等专科学校药学系，福建泉州 362000；2.福建医科大学附属协和医院药学部，福州 350001）

目的：建立测定人尿液中儿茶酚胺浓度的方法。方法：尿液样品经氧化铝提取后，以3，4-二羟基苄胺为内标，采用高效液相色谱-电化学法测定，色谱柱为Shim-Pack C18，流动相为混合溶液[每500 ml混合溶液中含离子对试剂（辛烷磺酸钠）0.5 mmol、甲醇10 ml、0.06 mmol/L二正丁胺50 μl、无水乙酸钠2.0 g、柠檬酸5.5 g、乙二胺四乙酸二钠60 mg和氯化钠584.4 mg，pH＝3.5]，流速为0.8 ml/min，柱温为30℃，电化学检测器检测电压为750 mV，进样量为40 μl。结果：去甲肾上腺素和肾上腺素的尿药浓度均在3.125～100 ng/ml范围内线性关系良好（r分别为0.998 5和0.999 2），定量下限均为3.125 ng/ml；日内、日间RSD均＜10%；方法回收率分别为99.2%～101.6%、98.9%～100.5%，提取回收率分别为63.8%～66.8%、60.5%～62.6%。结论：本方法特异性强、灵敏度较高、检测成本低，可用于人尿液中儿茶酚胺浓度的测定。

儿茶酚胺；去甲肾上腺素；肾上腺素；高效液相色谱法；电化学检测器；尿液

去甲肾上腺素（Norepinephrine，NE）和肾上腺素（Epinephrine，E）是人体内重要的儿茶酚胺类（Catecholamines，CAs）物质，与人们的健康和疾病有着密切的关系[1]。人体内CAs水平不仅可作为嗜铬细胞瘤的诊断依据，也有助于原发性高血压的鉴别诊断[2]；此外，嗜铬细胞瘤患者在药物麻醉、分娩及手术等情况下可能发生高血压或休克[3]，故检测此类患者体内CAs水平具有重要的临床意义。目前，对体内CAs水平的检测多采用血液样本，而血液中儿茶酚胺的质量浓度易受多种因素（如紧张、应激及低血糖等）的影响，且采血时静脉穿刺引起的疼痛也可导致患者CAs血药浓度升高[4]。因此，临床通过检测患者CAs的尿药浓度，可获得更为稳定、可靠的结果[5]。本试验在此基础上，建立了一种适用于临床且操作简便的CAs尿药浓度检测方法，以期为临床提供参考。

1 材料

1.1 仪器

LC-20A型高效液相色谱（HPLC）仪，包括LC-20AB型溶剂泵、SIL-20A型自动进样器、CTO-10Asvp型柱温箱及DGU-20AB型自动脱气装置（日本岛津公司）；Waters 2465型电化学检测器（美国Waters公司）；CP 114型精密分析天平（奥豪斯仪器上海有限公司）；TGL-16G型高速台式离心机（上海安亭科

学仪器厂）。

1.2 药品与试剂

NE对照品（批号：1001474257，纯度≥98%）、E对照品（批号：12325621，纯度≥98%）、3，4-二羟基苄胺对照品（DHBA，内标，批号：858781-250GM，纯度≥98%）均购自美国Sigma公司；离子对试剂[辛烷磺酸钠（IPR-B8），日本梯希爱（上海）化成工业发展有限公司，批号：5324845]；氧化铝[上海阿拉丁化学试剂公司（碱性，200～300目）]；无水乙酸钠、柠檬酸、氯化钠、乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na2）、硫代硫酸钠、盐酸、乙酸乙酯、二正丁胺等均为分析纯，甲醇为色谱纯，水为去离子水。健康尿液由本实验室工作人员（即健康志愿者）提供。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Shim-Pack C18（250 mm×4.6 mm，5µm）；流动相：混合溶液（每500 ml混合溶液中含IPR-B8 0.5 mmol、甲醇10 ml、0.6 mmol/L二正丁胺50 μl、无水乙酸钠2.0 g、柠檬酸5.5 g、EDTA-Na260 mg、氯化钠584.4 mg，pH＝3.5）；流速：0.8 ml/min；柱温：30℃；电化学检测器检测电压：750 mV；进样量：40µl。

2.2 溶液的配制

分别精密称取NE对照品8.0 mg、E对照品2.0 mg，用0.02 mol/L盐酸（含0.1%硫代硫酸钠）溶解并稀释，分别配制成NE、E质量浓度分别为0.80、0.20 mg/ml的对照品贮备液。

精密称取内标对照品400 mg，用0.02 mol/L盐酸溶解并稀释，配制成质量浓度为400 ng/ml的内标溶液。

上述溶液均置于冰箱（2～8℃）中避光保存，备用。

2.3 氧化铝的活化

取氧化铝10 g，加入2 mol/L盐酸50 ml，加热至100℃，搅拌45 min，静置1.5 min后弃去黄绿色上清液与细颗粒；于70℃下，加入2 mol/L盐酸25 ml，搅拌10 min，静置，弃去上清液，重复上述操作1次；于50℃下，加入2 mol/L盐酸50 ml，搅拌10 min，冷却，弃去上清液及悬浮颗粒；最后，用去离子水反复冲洗，至pH接近7.0，于200℃下烘烤4 h，冷却后干燥保存，备用[6]。

2.4 尿液样品收集与处理

将健康尿液在碱性条件（pH＝10）下于100℃煮沸，再用0.1 mol/L盐酸调节pH至4.0，即得空白尿液。取尿液5 ml，加入乙酸乙酯15 ml，振摇5 min，静置分层。取下层有机相0.5 ml至离心管中，依次加入内标溶液150 μl、0.1%硫代硫酸钠50 μl、1 mol/L三羟甲基氨基甲烷（Tris）500 μl和已活化的氧化铝60 mg，振荡5 min，以离心半径6 cm、转速10 000 r/min离心2 min，弃去上清液；沉淀依次用2 mol/L乙酸钠溶液2 ml洗涤1次、去离子水2 ml洗涤2次后，以离心半径6 cm、转速10 000 r/min离心2 min，弃去上清液；沉淀用吸水纸吸干，加入0.1 mol/L高氯酸200 μl，振荡5 min，以离心半径6 cm、转速13 000 r/min离心3 min后，吸取上清液40 μl进样分析。

2.5 专属性考察

在“2.1”项色谱条件下，内源性杂质对待测物无干扰，NE、E及内标的保留时间分别为6.818、8.709和11.638 min。HPLC图见图1。

2.6 标准曲线的制备

图1 高效液相色谱图A.空白尿样；B.空白尿样+NE+E+内标；C.健康志愿者尿样+内标；1. NE；2.E；3.内标Fig 1 HPLC chromatogramsA.blank urine；B.blank urine+NE+E+internal standard；C.urine sample from healthy volunteer+internal standard；1.NE；2.E；3.internal standard

精密吸取NE、E对照品贮备液及空白尿液各适量，配制成NE、E质量浓度均为100、50、25、12.5、6.25、3.125 ng/ml的系列尿液样品，按“2.4”项下方法处理后，进样分析，记录色谱图。以待测物与内标的峰面积比值（y）为纵坐标、待测物质量浓度（x）为横坐标进行线性回归，得NE、E的回归方程分别为：yNE＝0.062 3xNE+0.097 6（r＝0.998 5）、yE＝0.041 8xE+0.076 2（r＝0.999 2）。结果表明，NE、E尿药浓度均在3.125～100 ng/ml范围内线性关系良好，定量下限均为3.125 ng/ml。

2.7 精密度与回收率试验

2.7.1 精密度 分别配制NE低、中、高质量浓度（4、40、80 ng/ml，下同）的尿液样品和E低、中、高质量浓度（4、40、80 ng/ml，下同）的尿液样品，各5份，按“2.4”项下方法处理后，进样分析。于1日内分别测定5次，考察日内RSD；连续测定5 d，考察日间RSD。结果显示，两者日内、日间RSD＜10%。精密度试验结果见表1。

表1 精密度与回收率试验结果（s，n＝5）Tab 1 Results of precision and recovery tests（s ，n＝5）

表1 精密度与回收率试验结果（s，n＝5）Tab 1 Results of precision and recovery tests（s ，n＝5）

理论质量浓度，ng/ml待测物方法回收率，%提取回收率，% NE 4 E 40 80 4 40 80日内精密度实测质量浓度，ng/ml 3．91±0．15 38．58±1．24 82．36±3．71 3．85±0．10 38．62±1．43 78．58±3．30 RSD，% 3．8 3．2 4．5 2．6 3．7 4．2日间精密度实测质量浓度，ng/ml 3．85±0．14 37．27±1．53 78．69±4．80 3．75±0．12 37．62±1．62 77．98±3．74 RSD，% 3．4 4．1 6．1 3．1 4．3 4．8 99．5 99．2 101．6 99．6 98．9 100．5 63．8 65．2 66．8 62．6 61．3 60．5

2.7.2 方法回收率 分别配制NE及E低、中、高质量浓度的尿液样品，各5份，按“2.4”项下方法处理后，进样分析，按当日标准曲线计算两者的实测质量浓度，与理论质量浓度比较，考察方法回收率。结果显示，NE、E的方法回收率分别为99.2%～101.6%、98.9%～100.5%。方法回收率试验结果见表1。

2.7.3 提取回收率 分别配制NE及E低、中、高质量浓度的尿液样品，各5份，按“2.4”项下方法处理后，进样分析，得峰面积A；另取空白尿液0.5 ml，各5份，按“2.4”项下方法处理后，分别加入NE、E对照品贮备液各适量，使最终质量终浓度与前者对应，进样分析，得峰面积B。提取回收率＝A/B×100%。结果显示，NE、E的提取回收率分别为63.8%～66.8%、60.5%～62.6%。提取回收率试验结果见表1。

2.8 稳定性试验

分别配制NE及E低、高质量浓度的尿液样品，考察其在室

温（25℃）及4℃下放置的稳定性。各样品于室温25℃下避光保存，分别于0、1、3、6、12 h按“2.4”项下方法处理后，进样分析，重复操作3次；各样品于4℃冰箱中放置，隔日取出，室温融化，按“2.4”项下方法处理后，进样分析，重复操作3次，连续测定7 d。以0 h（25℃）或0 d（4℃）时NE或E的尿药浓度为100%，计算各样品中NE或E的相对百分含量，评价其稳定性。结果显示，在室温（25℃）下，各样品中NE和E的相对百分含量随时间的延长而明显下降，12 h后两者的相对百分含量均低于90%（NE、E分别降至85.2%和89.7%）；而在4℃条件下，NE和E的相对百分含量虽有下降趋势，但5 d后两者的相对百分含量仍＞95%，但放置7 d后，NE和E的相对百分含量分别降至94.2%和93.6%，提示各样品不宜在室温条件下保存，且在4℃冰箱中放置不宜超过5 d。

3 讨论

目前，多采取HPLC法检测人体内CAs水平，检测器多选用电化学检测器、荧光检测器和紫外检测器[7-8]。荧光、紫外检测器信号强度和灵敏度相对较低，而电化学检测器利用CAs可氧化的特性，通过电流信号放大，可检测出其他检测器无法监测到的物质，具有特异性强、灵敏度较高、检测成本低等特点。因此，高效液相色谱-电化学法被广泛应用于临床CAs质量浓度的监测[9]。

本实验在流动相中加入了离子对试剂（500 ml混合溶液中含0.5 mmol的IPR-B8），对NE和E具有良好的保留作用[10]。在流动相筛选过程中笔者发现，若减少了IPR-B8的加入量，NE色谱峰处会出现倒置的干扰峰，且难以通过调整流动相比例来消除其干扰，极大地影响了NE的定量分析。此外，若流动相中甲醇的比例过高，目标峰与杂质峰难以有效分离；而甲醇的比例过低，则会导致分析时间过长。故最终确定每500 ml混合溶液中甲醇的加入量为10 ml。

本试验采用氧化铝吸附提取尿液中的CAs，氧化铝的来源、粒径、酸碱性和干燥程度等均可影响CAs的提取效率[9]。笔者在前期试验中比较了不同来源氧化铝[天津市福晨化学试剂厂（中性，未注明目数）、西陇化工股份有限公司（中性，未注明目数）、上海阿拉丁化学试剂公司（碱性，100～200目或200～300目）]的提取效率，以选择最优类型氧化铝及其最佳用量。结果显示，上海阿拉丁化学试剂公司的碱性氧化铝（200～300目）的提取回收率最高（NE、E的提取回收率分别为65.2%、61.3%）；当氧化铝用量为60 mg时，提取回收率最高（NE、E的提取回收率分别为65.7%、63.3%）。氧化铝的提取回收率虽不及文献报道的阳离子交换柱（可达90%）[10-11]，但其在满足定量检测的基础上，成本较阳离子交换柱（仅可使用1次）低了很多。故本研究最终选择阿拉丁试剂公司的碱性氧化铝，并将其用量确定为60 mg。此外，在试验过程中，应注意保持氧化铝的干燥，防止其吸潮，影响提取效率。

尿液样品的pH会影响氧化铝的吸附活性，也会影响CAs的稳定性。氧化铝在pH为8.2～8.5条件下吸附CAs的能力最强，而CAs在碱性条件下却不稳定，两者存在矛盾[10]。前期试验以Tris缓冲液作为碱性媒介，对其浓度进行考察。结果显示，当Tris缓冲液浓度为1 mol/L时，提取回收率最高。此外，Tris缓冲液应尽快加入，以避免CAs在碱性条件下发生降解。

本研究考察了尿液样本常温下放置12 h和4.冰箱中放置7 d的稳定性。结果显示，室温放置12 h，尿液中的NE、E的相对百分含量分别降至85.2%和89.7%。4℃冰箱保存5 d后，NE、E的相对百分含量无明显变化，均维持在95%以上；而7 d后，NE、E的相对百分含量则下降至94.2%和93.6%。提示临床样本采样完毕后，应尽快送检，在冰箱中冷藏放置的时间也不宜超过5 d。

目前，采用尿液中CAs作为嗜铬细胞瘤的诊断标准并不统一。Lenders JW等[12]提出以24 h尿液中NE＞198µg、E＞31 µg作为确诊嗜铬细胞瘤的标准，而国内则以NE＞100µg、E＞50µg作为诊断标准[13]。本研究显示，NE及E的尿液浓度的线性范围均为3.125～100 ng/ml，以正常人平均24 h尿量1 000～2 000 ml计算，本方法可基本满足临床检测的要求。虽然本方法操作步骤较为烦琐，氧化铝也需定期活化，但本方法特异性强、灵敏度较高、检测成本低，适用于CAs尿药浓度监测。

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（编辑：张元媛）

Concentration Determination of Catecholamine in Human Urine by HPLC-Electrochemistry

CHEN Jing1，QIU Hongqiang2（1.Dept.of Pharmacy，Quanzhou Medical College，Fujian Quanzhou 362000，China；2.Dept.of Pharmacy，Fujian Medical University Union Hospital，Fuzhou 350001，China）

OBJECTIVE：To establish a method for the concentration determination of catecholamines in human urine.METHODS：After extracted by aluminum oxide，using 3，4-dihydroxybenzylamine as internal standard，HPLC-electrochemistry was performed on the column of Shim-Pack C18with mixed solution[every 500 ml mixed solution containing ion-pairing reagents（octane sulfonate）0.5 mmol，methanol 10 ml，0.06 mmol/L Di-n-butylamine 50 μl，sodium acetate anhydrous 2.0 g，citric acid 5.5 g，EDTA-Na260 mg and sodium chloride 584.4 mg，pH＝3.5]at a flow rate of 0.8 ml/min，column temperature was 30℃，detection voltage was 750 mV，and injection volume was 40 μl.RESULTS：The linear ranges were 3.125-100 ng/ml for both norepinephrine（r＝0.998 5）and epinephrine（r＝0.999 2），lower limits of quantitation were 3.125 ng/ml；RSDs of within days and daytime were lower than 10%，method recoveries were 99.2%-101.6%and 98.9%-100.5%，extraction recoveries were 63.8%-66.8%and 60.5%-62.6%.CONCLUSIONS：The method shows strong specificity，high sensitivity and low detection cost，and can be used for the concentration determination of catecholamines in human urine.

Catecholamines；Norepinephrine；Epinephrine；HPLC；Electrochemical detector；Urine

R917

A

1001-0408（2016）26-3627-03

2015-12-23

2016-06-04）

＊讲师，硕士。研究方向：药理学。电话：0595-22783475。E-mail：825649654@qq.com

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2016.26.08