光肩星天牛触角cDNA文库构建及质量分析1)

李慧恩 王志刚 沈腾维 阎爱华

(河北省林木种质资源与森林保护重点实验室(河北农业大学)，保定，071001)



光肩星天牛触角cDNA文库构建及质量分析1)

李慧恩 王志刚 沈腾维 阎爱华

(河北省林木种质资源与森林保护重点实验室(河北农业大学)，保定，071001)

以新羽化的光肩星天牛(Anoplophoraglabripennis)雄成虫触角为材料，采用RNA转录5′末端转换(SMART)技术构建全长cDNA文库。经验证，该文库容量为1.35×106pfu/mL，重组率为95%。从中随机挑取48个克隆进行表达序列标签(ESTs)测序，有效序列为45条，其中35条序列有相关同源信息，24条为全长序列，完整性比率为68.6%。

光肩星天牛；触角；cDNA文库；表达序列标签(ESTs)

光肩星天牛(Anoplophoraglabripennis)属鞘翅目(Coleoptera)，天牛科(Cerambycidae)，是我国北方地区杨树、柳树、榆树、槭树等阔叶树种的重要害虫，成虫取食嫩枝和叶片主脉，幼虫钻蛀树干，上下活动取食，形成大量蛀道，使树干机械强度严重下降，甚至造成林木整株死亡，是钻蛀类害虫的代表性种类[1-4]。对光肩星天牛脑部解剖结构的研究表明，相对于其他感觉功能，天牛的中脑触角叶较大，嗅觉最发达[5]。超微结构观察显示，触角是昆虫感受器最富集的器官，具有嗅觉、触觉和味觉等多种感受功能，机械感器和化学感器的种类和数量都远多于其他感器，在昆虫的寄主定位和配偶选择过程中起到了重要作用[6-7]。因此，加强对光肩星天牛触角的研究有利于明确天牛的生理生化特性和行为学特征，为天牛的无公害防治奠定基础。当前的研究主要集中在寄主挥发物信息对天牛触角的电化学反应方面[8-10]，对触角功能的分子生物学研究很少。王伟等[11]利用mRNA差异显示体系(DDRT-PCR)发现了在光肩星天牛触角中特异表达的28条序列，涉及化学感受、觅食等相关功能，但目前还未见到这种天牛功能基因克隆的报道。

构建cDNA文库能够全面发掘器官、组织的新基因，明确基因功能，是系统研究功能基因组的重要方法。松褐天牛(Monochamusalternatus)[12-13]、家蝇(Muscadomestica)[14]、铜绿丽金龟(Anomalacorpulenta)[15]、大草蛉(Chrysopapallens)[16]、美国白蛾(Hyphantriacunea)[17]等农林害虫已成功构建了cDNA文库，获得了大量功能基因信息。本研究以光肩星天牛雄虫触角为试验材料，通过构建光肩星天牛触角全长cDNA文库并结合ESTs序列分析，对该天牛包括嗅觉、味觉、触觉在内的功能基因进行全面挖掘和分析，为探明天牛触角感器功能的分子机制和感觉相关功能蛋白的相互作用机制提供线索，同时有利于了解光肩星天牛感觉器官控制行为反应的内在机制，为研究其他昆虫的感觉机制提供了新的思路，有助于丰富光肩星天牛的行为控制技术，为进一步开发出引诱剂、驱避剂和干扰剂奠定基础。

1 材料与方法

供试昆虫：试虫采自河北省灵寿县，在羽化前将有排粪孔的柳树木段带回实验室保湿，昆虫羽化后在冰上将其触角切下，液氮中迅速冷冻，放入冰箱，-80 ℃保存。

主要试剂：In-Fusion®SMARTer®Directional cDNA Library Construction Kit和Advantage 2 Polymerase Mix购自Clotech公司；PCR产物纯化及回收试剂盒QIAquick PCR Purification Kit购自Qiagen公司；SfiI酶购自NEB公司；DL2000 Marker购自TaKaRa公司。

总RNA提取：由于光肩星天牛触角的几丁质含量较高，为了获得高质量的触角总RNA，比较了液氮人工研磨法和匀浆器匀浆法2种研磨方法的效率，并按照说明书用Trizol法提取触角总RNA。用1%琼脂糖凝胶电泳和紫外吸收法测定、计算总RNA的纯度与比值，以检测RNA质量。

cDNA的合成及分级分离：按照In-Fusion®SMARTer®Directional cDNA Library Construction Kit说明书构建触角全长cDNA文库，LD PCR产物用蛋白酶K消化，SfiI酶切后，分级分离cDNA，收集酶切产物并用电泳检测质量。cDNA与pMD19-T相连转化大肠杆菌DH-5α感受态后涂板，获得光肩星天牛触角cDNA质粒文库。

文库质量检测和重组率鉴定：计算菌落数与蓝白斑的比例，得到文库滴度、库容量，以此初步鉴定所构建的文库质量。从构建的光肩星天牛雄虫触角cDNA质粒文库中随机挑取48个克隆，用M13通用引物进行菌落PCR。反应结束后取5 μL产物进行1%琼脂糖凝胶电泳分析插入片段大小。计算公式如下：

库容量=菌落数×连接产物量。

文库滴度=(菌落数×稀释倍数×103)/所用文库体积。

重组率=转化噬菌斑/菌落总数。

文库的保存：将挑取的阳性克隆置于1 mL加入Amp的LB培养液中，37 ℃培养至浑浊，将85 μL菌液与15 μL灭菌甘油混合后加入96孔细胞培养板，编号，在超低温冰箱中-80 ℃保存。

ESTs序列测定与比对：从构建的cDNA文库中随机挑取48个独立克隆测序，测序得到的序列进行去载体、聚类拼接，拼接得到的Unigenes用Blastx程序进行同源性比较，计算完整性比率。将筛选出的阳性克隆进行测序，测序委托上海生工生物工程技术服务有限公司(Sangon)完成。将测序结果去除冗余序列并采用GeneBank(www.ncbi.nlm.nih.gov)中的Blastx程序对测序结果进行同源性检索和序列分析。

2 结果与分析

2.1 总RNA的提取质量

把手动研磨和匀浆仪研磨2种研磨方法提取的光肩星天牛触角总RNA用1%琼脂糖凝胶电泳检测(图1)，28 S和18 S核糖体RNA条带清晰明亮，边缘锐利，无拖尾。经检测，研磨样品提取得到的总RNAA260/A280为2.01，匀浆仪粉碎样品提取得到的总RNAA260/A280为2.09。因此，说明2种提取方法获得的RNA无降解，纯度较好，均可进行下一步的试验。

2.2 cDNA第一链和第二链合成

以光肩星天牛触角总RNA反转录合成第一链cDNA，经LD-PCR合成第二链cDNA。1%琼脂糖凝胶电泳分析显示，条带弥散均匀，片段主要集中于500～2 000 bp(图2)，表明双链cDNA合成成功。

1.手动研磨；2.匀浆仪研磨。

图2 光肩星天牛触角双链cDNA电泳

2.3 cDNA文库质量评价

将光肩星天牛触角cDNA酶切片段与pMD19-T载体连接形成重组质粒，然后转化大肠杆菌E.coliDH5α菌株，得到菌落数大于1 500，构建了相应文库，重组率为95%，满足文库构建的一般要求。文库滴度为1.5×109pfu/mL，库容量为1.35×106pfu/mL。随机选取48个克隆，用M13通用引物进行菌落PCR，扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析(图3)表明，插入片段大小为500～2 000 bp。因此，构建的光肩星天牛触角cDNA文库质量较高，符合要求。

2.4 cDNA质粒文库的ESTs分析

随机挑选48个克隆送上海生工公司进行序列测定，并对所得序列进行质量评估和拼接，对于峰图比较好的序列去除载体得到45条有效序列。利用Blastx程序，将上述获得的序列与GeneBank的nr数据库和EST数据库进行同源性对比分析(表1)，结果显示，45条序列中有35条序列有相关同源信息，其中24条为全长序列，完整性比率为：24/35=68.6%。10条序列(占22%)未在GeneBank中找到同源序列，这些序列可能是光肩星天牛的特异基因序列，新基因部分登录在GeneBank中，登录号为gb|AKM70275.1|。从功能上看，已知功能的同源基因涉及包括氨基酸代谢、电子传递、性激素合成与识别、能量合成与代谢、化学感受等不同家族不同功能。其中，与化学感受相关的基因十分丰富，可能与嗅觉相关的基因有C端气味结合蛋白1-4、穿膜蛋白107异构体、矿化蛋白、化学感受蛋白等。没有具体功能的基因序列为16条，可能成为新的功能候选基因。

图3 随机挑取的48个克隆的PCR产物电泳图谱

表1 光肩星天牛触角ESTs序列Blastx比对结果

3 结论与讨论

RNA的质量是构建全长文库的关键。cDNA文库的代表性以及插入片段的完整性是评价建库质量的2个标准[18-19]。理论上每个cDNA文库应至少包含3.3×105个独立克隆。本研究构建的cDNA文库包含1.35×106个独立克隆，插入片段主要集中于500～2 500 bp，重组率约为95%，完整性比率为68.6%，符合构建全长cDNA文库的要求。经测序，得到45条有效序列，35条同源序列，24条全长序列，具有已知功能的光肩星天牛ESTs 20个。

很多研究者报道，气味结合蛋白和化学感受蛋白都与昆虫感觉机制相关，尤其是嗅觉[20-21]。构建cDNA文库是挖掘功能基因的有效手段之一。Zeng et al.[22]从稻纵卷叶螟(Cnaphalocrocismedinalis)触角文库中分离cDNA克隆，发现了8个嗅觉基因，包括2个普通气味结合蛋白(GOBPs)基因、3个信息素结合蛋白(PBPs)基因和3个化学感受蛋白(CSPs)。Zeng et al.[23]分析西花蓟马(Frankliniellaoccidentalis)触角cDNA文库鉴定出2个嗅觉基因，分别编码PBP、CSP；Li et al.[24]将云斑天牛(Batocerahorsfields)成虫触角全长cDNA文库测序发现18个蛋白基因，用RT-PCR技术克隆得到3个CSP基因BhorCSP1、BhorCSP1、BhorCSP1和3个GOBP基因BhorGOBP1、BhorGOBP2、BhorGOBP3。本试验通过Blastx比对，发现一些具有特殊功能的基因序列，如四联跨膜蛋白，推测其在光肩星天牛嗅觉信号转导过程中起重要作用；同时发现了很多与代谢和能量转化相关的基因，具体的功能还需后续进行相关试验鉴定。这些为筛选克隆光肩星天牛重要功能基因，分析光肩星天牛感觉机制、生理行为学的本质奠定了基础，为无公害防治光肩星天牛提供新思路和新方法。虽然光肩星天牛触角cDNA文库已经成功构建，但是本试验获得的基因仍然有限，以后研究还应该通过高通量测序获取更多的基因，为光肩星天牛遗传图谱的建立提供数据。

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Construction and Primary Analysis of Full Length cDNA Library ofAnoplophoraglabripennisAntenna//

Li Huien, Wang Zhigang, Shen Tengwei, Yan Aihua

(Key Laboratory of Germplasm Resources of Forest and Forest Protection of Hebei Province, Agricultural University of Hebei, Baoding 071001, P. R. China)//Journal of Northeast Forestry University，2016,44(11)：96-99.

The full length cDNA library ofAnoplophoraglabripennisantenna was constructed by SMART RNA (switching mechanism at 5′end of RNA transcript) which consisted of 1.35×106pfu/mL and the recombinant percentage was 95%. Forty-eight clones were randomly selected from the cDNA library, the ESTs (expressed sequence tags) were sequenced. Forty-five were effective, 35 homologous sequences which contained 24 full-length sequences were found by blasted in the NCBI nonredundant nucleotide databases, and the integrity ratio of the full-length sequences was 68.6%.

Anoplophoraglabripennis; Antenna; cDNA Library; Expressed sequence tags

1)河北省教育厅杰出青年基金项目(YQ2014022)；河北省自然科学基金项目(C2012204098)。

李慧恩，女，1991年11月生，河北省林木种质资源与森林保护重点实验室(河北农业大学)，硕士研究生。E-mail：994721417@qq.com。

阎爱华，河北省林木种质资源与森林保护重点实验室(河北农业大学)，副研究员。E-mail：yanaihua@hebau.edu.cn。

2016年4月18日。

S763.38

责任编辑：程 红。