青钱柳叶水提物对阴虚内热型2型糖尿病大鼠中医表征和免疫功能的改善作用

任文康，胡明华，尹西拳，连大卫，扶丽君，操红缨，江伟雯，范平龙，许艺飞，黄萍

（1.广州中医药大学，广东广州510006；2.无限极中国有限公司，广东广州510665）

青钱柳叶水提物对阴虚内热型2型糖尿病大鼠中医表征和免疫功能的改善作用

任文康1，胡明华2，尹西拳2，连大卫1，扶丽君1，操红缨1，江伟雯1，范平龙1，许艺飞1，黄萍1

（1.广州中医药大学，广东广州510006；2.无限极中国有限公司，广东广州510665）

【目的】探讨青钱柳叶水提物对阴虚内热型2型糖尿病大鼠中医表征和免疫功能的作用。【方法】将60只SPF级SD大鼠随机分为正常组，模型组，知柏地黄丸组，青钱柳叶水提物高、中、低剂量组。复制阴虚内热型2型糖尿病大鼠模型：大鼠给予高脂饲料喂养，喂养第4周时，按0.2 mg·kg-1·d-1剂量连续皮下注射甲状腺素（T4）7 d；第5周时，一次性腹腔注射链脲佐菌素（STZ）35 mg/kg，3周后造模结束。模型复制成功后，除正常组和模型组外，其余各组给予相应药物灌胃治疗4周。每周观察中医证候指标并评分。末次给药后，观察空腹血糖（FBG）值变化、血糖曲线下面积（AUC）及血清中尿素（Urea）含量；取肝脏称质量计算肝指数，并检测肝组织肝糖原含量；检测CD3+、CD4+和CD8+T淋巴细胞百分比。【结果】与模型组比较，给予青钱柳叶水提物治疗之后，阴虚内热型糖尿病中医表征表现如背部温度上升、舌色鲜红、活动次数明显增加、爪色青紫及眼睛神采异常等均有明显的改善（P＜0.05或P＜0.01），FBG、AUC、Urea含量和肝脏系数下降（P＜0.05或P＜0.01），肝糖原含量升高，CD8+T细胞百分比升高，CD4+T细胞百分比及CD4+/CD8+值下降（P＜0.05或P＜0.01）。【结论】青钱柳叶水提物能改善大鼠阴虚内热型2型糖尿病中医表征及调节免疫功能。

青钱柳叶水提物/药理学；2型糖尿病/中药疗法；中医表征；阴虚内热证；糖代谢；肝肾功能；免疫功能；疾病模型，动物；大鼠

青钱柳[Cyclocarya paliurus（Batal.）Ijinsk.]为双子叶植物刚胡桃科青钱柳叶属植物，是我国特有的单种属植物，主要生长于广东、广西、四川、江西等省份[1]。据《中国中药资源志要》记载，青钱柳入药部位为树叶、树皮，性温，味辛微苦，具有清热消肿、解毒、止痛等功效[2]。民间常采摘青钱柳叶制成甜茶，认为其具有甘甜滋润、生津止渴等保健作用，食用历史悠久[3]。也有文献[4-6]报道青钱柳叶含有丰富的生物活性成分，有潜在的开发和实用价值。本实验观察了青钱柳叶对阴虚内热型2型糖尿病模型大鼠中医表征的改善作用，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 仪器ACCU-CHEK ACTIVE罗氏活力型血糖仪（德国Roche公司），罗康全活力型试纸（德国Roche公司），EL204型电子分析天平（瑞士梅特勒—托利多仪器有限公司），ZX57486型移液枪（美国Thermo公司），低温离心机（美国Thermo公司），超低温冰箱（美国NEW Brunswick Scientifi公司），非接触式红外线体温计（深圳旭一有限公司），7180型生化分析仪（日本日立公司），1510型酶标仪（美国Thermo公司），UV-5510PC紫外可见光分光光度计（广州市绿向生物科技有限公司），FACS CantoⅡ流式细胞仪（美国BD公司）。

1.2 药物与试剂青钱柳叶提取物（提取方法：2 kg青钱柳叶，剪碎，加20倍水煎煮，过滤，滤渣再加20倍水，煎煮1 h，合并滤液，浓缩，干燥，获得浸膏，1 g干膏含有生药7.57 g）；知柏地黄丸（北京同仁堂，批号：14030755），临用前配成0.3 g/mL混悬液；链脲佐菌素（STZ，日本TOKU-E公司）；左旋甲状腺素（德国默克公司，批号：191113）；葡萄糖（广州化学试剂厂）；柠檬酸（天津市光复科技发展公司）；柠檬酸钠（天津市光复精细化工研究所）；游离脂肪酸酶联免疫分析试剂盒（南京建成生物工程研究所，批号：20160223）；肝糖原检测试剂盒（南京建成生物工程研究所，批号：20150929）；糖化血红蛋白检测试剂盒（南京建成生物工程研究所，批号：20151012）；Anti-Rat CD8、Anti-Rat CD3、Anti-Rat CD4（均由美国eBioscience公司提供）。

1.3 实验动物及饲料60只SPF级SD大鼠，体质量100～140 g，雌雄各半，购于广州中医药大学，许可证号：SCXK（粤）2013-0034。高脂饲料由猪油、蛋黄粉、蔗糖、基础维持饲料等组成，由北京科澳协力有限公司提供，许可证号：SCXK（京）2014-0010。

1.4 实验分组与动物造模[7]将60只大鼠随机分为正常组，模型组，知柏地黄丸组（阳性对照组），青钱柳叶水提物高、中、低剂量组（以下简称中药高、中、低剂量组）。大鼠适应性饲养1周后，正常组给予普通饲料喂养，其他各组大鼠给予高脂饲料喂养。高脂饲料喂养第4周，除正常组外，其他各组动物给予0.2 mg·kg-1·d-1甲状腺素（T4）皮下注射，连续注射1周；第5周，一次性腹腔注射STZ溶液35 mg/kg（正常组腹腔注射等体积0.1 mol/L柠檬酸—柠檬酸钠缓冲液）。注射STZ后第7天，动物禁食测空腹血糖（FBG），以FBG≥7.8 mmol/L为模型血糖标准；注射STZ 3周后，阴虚内热型2型糖尿病模型复制完成。造模成功后，各治疗组分别给予相应药物灌胃，知柏地黄丸给药剂量为1.5 g/kg，青钱柳叶提取物高、中、低给药剂量分别为0.132、0.066、0.033 g/kg，给药时间为4周。

1.5 中医表征观察参考吴晏等[7]实验体征记录方法，观察大鼠中医表征的变化。

1.6糖代谢指标检测动物禁食不禁水12 h，尾尖采血，血糖试纸检测FBG；末次给药后，给予质量分数为40%的葡萄糖2 g/kg大鼠灌胃，于0、30、60、90、120 min检测血糖值，并计算血糖曲线下面积（AUC），公式：AUC=（0 min血糖值+30min血糖值）×0.5+（30 min血糖值+60 min血糖值）×0.5 +（60 min血糖值+90 min血糖值）×0.5+（90 min血糖值+120 min血糖值）×0.5。

1.7 肝肾功能指标检测末次给药后，经大鼠腹主动脉取血清，采用全自动生化仪检测尿素（Urea）含量；解剖大鼠取肝组织，测定肝组织中糖原含量，具体操作参照试剂盒说明书。

1.8 免疫功能指标检测取大鼠外周血置于抗凝管中，加入体积分数为3%的等体积明胶溶液，混匀。室温下静置30 min，取0.3 mL上清液，以2 000 r/min转速离心5 min，加入红细胞裂解液0.5 mL，混匀。震荡5 min，以2 000 r/min转速离心5 min。加入1 mL磷酸盐缓冲液（PBS），以2 000 r/min转速离心5 min，去除上清液后，加入0.2 mL PBS。检测前加入CD3，CD4、CD8抗体，孵育1 min，此操作尽量避光。用FACS CantoⅡ流式细胞仪测得CD3+、CD4+、CD8+T淋巴细胞百分比和CD4+/CD8+值，并记录数据。

1.9 统计方法采用SPSS 20.0统计软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差检验和最小显著性差异法（LSD），以P＜0.05为差异有统计意义。中医表征评分表中，各表征比率为该表征占总数的比率，计数资料数据以率表示，采用χ2检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

表1 各组2型糖尿病大鼠阴虚内热症状表征评分比较Table 1Scores of TCM symptoms of T2DM rats with Yin deficiency generating intrinsic heat syndrome in various groups（p）

2 结果

2.1 青钱柳叶水提物对阴虚内热型2型糖尿病大鼠中医表征的影响表1结果显示：给药前，模型组与正常组比较，舌色鲜红比率显著升高（P＜0.05），其余表征差异无统计学意义（P＞0.05）；在给药1～4周期间，模型组大鼠活动次数、背部温度、舌色变红等表征的出现比率呈上升趋势；第3周后，与正常组比较，模型组大鼠各中医表征差异均有统计学意义；在给予中药的4周内，中药各剂量组较模型组各种表征出现比率呈不同程度的降低（P＜0.05或P＜0.01）。

2.2 青钱柳叶水提物对阴虚内热型2型糖尿病大鼠糖代谢的影响表2结果显示：给药前，模型组大鼠FBG显著高于正常组（P＜0.01），末次给药后，模型组大鼠FBG和AUC亦显著高于正常组（P＜0.01）；在给予中药治疗后，FBG和AUC均呈降低趋势，末次给药后（除中剂量组）这2个指标降低与模型组比较，差异均有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）。

表2 青钱柳叶水提物对2型糖尿病大鼠FBG和AUC的影响Table 2Effect of Cyclocarya paliurus（Batal.）Ijinsk aqueous extracts on FBG and AUC of T2DM rats in various groups[x±s，c/（mmol·L-1）]

2.3 青钱柳叶水提物对阴虚内热型2型糖尿病大鼠肝肾功能的影响表3结果显示：与正常组比较，模型组大鼠肝脏系数、尿素含量均显著升高（P＜0.01），肝糖原含量显著降低（P＜0.01）。给予中药治疗后，各治疗组大鼠肝脏系数呈不同程度的恢复（P＜0.05或P＜0.01）；中药高、低剂量组大鼠肝糖原含量均有所恢复，且高剂量组与模型组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；各给药组大鼠尿素含量均较模型组降低，差异有统计学意义（P＜0.01）。

表3 青钱柳叶水提物对2型糖尿病大鼠肝肾功能的影响Table 3 Effect of Cyclocarya paliurus（Batal.）Ijinsk aqueous extracts on liver and kidney function of T2DM rats in various groups（x±s）

2.4 青钱柳叶水提物对2型糖尿病大鼠免疫功能的影响表4结果显示：与正常组比较，模型组CD3+T淋巴细胞百分比差异无统计学意义（P＞0.05），CD4+T淋巴细胞百分比显著上升，CD8+T淋巴细胞百分比显著下降，CD4+/CD8+值显著上升（均P＜0.01）。经过中药治疗后，低剂量组CD4+T淋巴细胞百分比显著下降，中剂量组CD8+T淋巴细胞百分比明显上升，3个剂量青钱柳叶水提物均能显著降低CD4+/CD8+值（均P＜0.01）。

3 讨论

糖尿病是一种由遗传和环境等多种因素引起的代谢紊乱综合征，其中大部分为2型糖尿病，严重地影响着现代人的生活质量，成为世界普遍关注的经济公共卫生问题。糖尿病属中医“消渴”范畴，以多饮、多尿、多食及消瘦等症状为主要特征，中医辨证分为阴虚内热、气阴两虚、阴阳两虚等证型，按糖尿病病程分为早、中、晚期3个阶段，分别以养阴生津、营卫益气、温阳育阴等方法进行辨治，在临床上使用取得较好疗效[8]。2型糖尿病早期多以热盛证候为主，兼有阴虚，以五心烦热，头晕耳鸣，腰膝酸软，骨蒸潮热，两颧潮红，口干舌燥，盗汗遗精，舌红少苔等为主要表征；2型糖尿病中期以气虚证候为主，兼有阴虚，热在气分，汗出不彻，久而伤及气阴，或热盛耗伤津液，气随液脱；2型糖尿病晚期以阳虚证候为主，兼有阴虚，以畏寒亦怕热的典型表征，与久病脏腑不和，失运失司，营卫不和以致外邪不御、阴阳不和的证候为特征。故阴虚病机被认为贯穿疾病的始终。因此，我们首选滋阴清热类中药进行相关药理学研究。

表4 青钱柳叶水提物对糖尿病大鼠免疫功能的影响Table 4 Effect of Cyclocarya paliurus（Batal.）Ijinsk aqueous extracts on immune function of DM rats in various groups（x±s，p/%）

青钱柳叶作为一种具有甘润兼清热特质的资源，其降血糖作用已引起许多学者的关注[4-6]，但其有效化学成分对2型糖尿病阴虚状态和免疫功能的作用不甚清楚。本研究采用高脂饲料喂食+注射STZ与T4方法建立阴虚内热型糖尿病动物模型[8-11]，应用青钱柳叶水提物进行干预，观察其对2型糖尿病病理改变及中医表征的调节作用。结果表明，青钱柳叶水提物具有改善阴虚内热型糖尿病大鼠中医表征，纠正糖代谢紊乱及肝肾功能、免疫功能失调的作用。

本实验对青钱柳叶水提物滋阴及其调节免疫功能的药理活性作了初步研究，有关其作用机制及其他药理活性筛选还有待进一步探讨。

［1］中国科学院中国植物志编辑委员会.中国植物志［M］.北京：科学出版社，1979：19.

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［7］吴晏，韩静，黄黎明，等.糖尿病模型大鼠表征及其证候动态演变研究［J］.辽宁中医杂志，2011，38（11）：2279.

［8］林兰.现代中医糖尿病学［M］.北京：人民卫生出版社，2008：150-153.

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［11］付晓伶，方肇勤.阴虚证动物模型的造模方法及评析［J］.上海中医药大学学报，2004，18（2）：51.

【责任编辑：黄玲，侯丽颖】

Effect of Cyclocarya paliurus（Batal.）Ijinsk Aqueous Extracts on Improving Traditional Chinese Medical Symptoms and Immune Function of Type 2 Diabetic Mellitus Rats with Yin Deficiency Generating Intrinsic Heat Syndrome

REN Wenkang1，HU Minghua2，YIN Xiquan2，LIANDawei1，FU Lijun1，CAO Hongying1，JIANG Weiwen1，FAN Pinglong1，XU Yifei1，HUANGPing1
（1.Guangzhou UniversityofChinese Medicine，Guangzhou 510006 Guangdong，China；2.Infinitus（China）CompanyLtd.，Guangzhou 510665 Guangdong，China）

ObjectiveTo investigate the therapeutic effect of Cyclocarya paliurus（Batal.）Ijinsk aqueous extracts for improving traditional Chinese medical（TCM）symptoms and immune function of Type 2 diabetic mellitus（T2DM）rats with Yin deficiency generating intrinsic heat syndrome.MethodsSixty specific-pathogen free（SPF）SD rats were randomly divided into model group，positive control group（Zhibai Dihuang pills），and high-，middle-and low-dose Cyclocarya paliurus groups.To establish the T2DM rat model with Yin deficiency generating intrinsic heat syndrome，we fed the rats with high-fat diet，gave subcutaneous injection of 0.2 mg· kg-1·d-1of thyroid hormone（T4）for 7 continuous days from the 4thweek of feeding，and gave one-dose intraperitoneal injection of 35 mg/kg of streptozotocin on the 5thweek.Three weeks later，the modeling was completed.After successful establishment of the model，medication groups were administrated with correspondingmedicine for 4 weeks.The scores of traditional Chinese medical syndromes in various groups were observed every week.After the last intragastric administration，we detected the fasting blood glucose（FBG），calculated the oral glucose area under the curve（AUC），examined serum urea content，observed CD3+，CD4+，CD8+T lymphocyte percentages and CD4+/CD8+levels，and sampled the liver for calculating liver index and hepatic glycogen content.ResultsCompared with the model group，the TCM symptoms such as increase of back temperature，bright reddish tongue，hyperactivities，blue-purplish paw，andabnormal eyesight of the rats in Cyclocarya paliurus groups were much improved（P＜0.05 or P＜0.01），and FBG，AUC，serum urea content and liver index were decreased（P＜0.05 or P＜0.01），while hepatic glycogen content was increased，CD8+T cells percentage was enhanced，CD4+T cell percentage and CD4+/CD8+value were decreased（P＜0.05 or P＜0.01）.ConclusionCyclocarya paliurus（Batal.）Ijinsk aqueous extracts can improve TCM symptoms of T2DM rats with Yin deficiency generating intrinsic heat syndrome，and regulate the immune function of the rats.

Cyclocarya paliurus（Batal.）Ijinsk aqueous extracts/pharmacology；diabetic mellitus/TCD therapy；traditional Chinese medical symptoms；Yin deficiency generating intrinsic heat syndrome；glucose metabolism；hepatorenal function；immune function；disease models，animal；rats

285.5

A

1007-3213（2016）06-0851-05

10.13359/j.cnki.gzxbtcm.2016.06.022

2016-06-08

任文康（1993-），男，硕士研究生；E-mail：ren22@126.com

黄萍（1960-），女，教授；E-mail：hping331@126.com

广州中医药大学中药学院高水平大学建设项目（编号：2013）