阴道加德纳菌的保存方法比较*

陈远翔，向 军

(重庆市万州区妇幼保健院 404000)



·个案与短篇·

阴道加德纳菌的保存方法比较*

陈远翔，向 军

(重庆市万州区妇幼保健院 404000)

阴道加德纳菌； 保存方法; 比较

细菌性阴道病(BV)，也称特异性阴道炎，临床表现为妇女阴道分泌物增多、伴有典型的腥臭味、呈灰白色、均匀稀薄、黏度较低。阴道加德纳菌(GV)是细菌性阴道病的重要致病菌之一[1-2]。GV感染可引起输卵管异位妊娠、胎膜早破、产褥期感染、新生儿早产等不良妊娠结局[3-4]。最新报道GV能明显刺激人类免疫缺陷病毒(HIV)在单核-巨噬系统T淋巴细胞中的表达，与HIV的传播率增高有关[5]。菌种保存是分析该菌株流行病学、耐药性变迁、医院感染病原学调查的基础，一般常用的菌种保存方法有多种[6-8]，如：冷冻干燥保存法、磁珠法、滤纸法、肉汤保存法等。本文采用3种不同方法保存阴道加德纳菌，旨在为临床筛选出操作简便、实用、成本低廉的保存方法，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 菌株和培养基 共51株，其中50株为本院2014～2015年妇产科门诊患者泌尿生殖道分泌物中的分离菌，1株为标准菌株(ATCC 14018)(上海宝录生物公司代购，批号410-89-2)，人血哥比琼脂培养基(自制)。

1.2 保存介质 滤纸(杭州富阳)，甘油(四川西陇化工)，脱脂奶粉(内蒙古伊利)。

1.3 仪器设备 -18 ℃冰箱(德国西门子)，-80 ℃冰箱(日本三洋)，CO2水套式恒温箱(上海博讯)，生物安全柜(济南鑫贝西)。

1.4 方法

1.4.1 标准菌株复苏 标准菌种平衡至室温后打开外包装，捏碎菌种顶部内安瓶部分，使水化液流入含有菌种的底部，然后反复挤压软管底部促使细菌悬液分布均一。取出已经浸透细菌悬液的拭子接种于人血哥伦比亚琼脂培养基[9]，35 ℃，5% CO2孵育48 h。

1.4.2 滤纸保存法 将普通定性滤纸剪成2.5×0.8 cm条状物高压灭菌备用(121 ℃，15 min)，无菌操作滤纸刮取经过5% CO2孵育48 h的菌株放入无菌EP管，用胶袋封口。

1.4.3 甘油保存法 EP管加入1 mL甘油高压灭菌(121 ℃，15 min)，无菌操作滤纸刮取经过5% CO2孵育48 h的菌株，放入已灭菌的无菌甘油EP管中，用胶袋封口。

1.4.4 牛奶保存法 10 g脱脂奶粉，0.5 g NaCl加入100 mL蒸馏水，搅拌溶解后每支EP管分装1 mL高压灭菌(121 ℃，15 min)，无菌操作滤纸刮取经过5% CO2孵育48 h的菌株，放入已灭菌的无菌牛奶EP管中，用胶袋封口。

1.4.5 菌种保存 将上述3种方法制备好的菌株分别置于-18 ℃和-80 ℃冰箱保存。

1.4.6 阴道加德纳菌复苏 分别于1、2年将阴道加德纳菌纳菌接种于人血哥比琼脂培养基，5% CO2孵育48 h后观察。每株每种方法复苏3支菌，计算平均存活率。

1.4.7 复苏后菌种鉴定 法国梅里埃API-Coryne棒状杆菌鉴定试剂盒。

1.5 统计学处理 采用SPSS19.0统计软件进行分析，计数资料以率表示，比较采用χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

阴道加德纳菌按照不同方法分别置于-18 ℃和-80 ℃冰箱，回复至室温后再取出接种。5% CO2孵育48 h，细菌生长情况见表1、2。

表1 阴道加德纳菌3种保存方法(-18 ℃)

表2 阴道加德纳菌3种保存方法(-80 ℃)

如表1所示：-18 ℃保存，牛奶保存法12、24个月存活率分别为100.0%和78.4%，甘油保存法分别为3.9%、0%，滤纸法均为0%。3种方法之间差异均有统计学意义(P<0.05)。表2显示-80 ℃条件下，每种保存方法相对于-18 ℃存活率都有所提高，3种方法组间差异均有统计学意义(P<0.05)。由表1、2可知：在加入保护剂(甘油、牛奶)的保存环境比单独只采用滤纸保存效果更好，-80 ℃比-18 ℃保存效果更好。经统计学比较，-80 ℃牛奶保存法12、24个月存活率为100.0%、92.2%与其他两种方法比较，差异有统计学意义(P<0.05)。

复苏后菌种采用法国梅里埃API-Coryne棒状杆菌试剂盒鉴定，成功复苏的菌种生化反应均没有变化，与目标菌鉴定结果相符。

3 讨 论

菌种保存的基本原理是挑选适宜的介质环境使其处于休眠状态，降低新陈代谢速度，长期保存后仍能保持菌种原有的优良特性。基本措施：低温、真空、干燥、加入保护剂。目前，国内大多数文献所报道采用冷冻真空干燥法保存效果最好[10-11]。此法是将微生物在低温中迅速冷冻，真空状态下脱水干燥密封而成。但真空干燥设备价格昂贵，操作繁琐，不适于医院菌种保存工作中普遍开展。国内学者徐雅娟等[12]将牛奶保存法应用于金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌等29种临床常见细菌保存，结果发现菌株保存36个月后显示存活率100.0%。罗桂梅等[13]采用牛奶保存法保存85株淋球菌，2年内复活率97.7%。表明牛奶保存法不仅可以用于普通细菌的保存，同样也可应用于苛养菌的保存。

阴道加德纳菌属苛养菌，营养要求高，在已有的文献中没有专门针对此菌的保存方法研究[14-15]。本文比较3种方法对阴道加德纳菌的保存效果，结果发现：-80 ℃牛奶保存法12、24个月存活率分别为100.0%、92.2%，相比于其他方法，差异有统计学意义(P<0.05)。研究同时表明，低温对于阴道加德纳菌保存有明显延长作用，其中甘油法-80 ℃，12个月存活率(84.0%)明显高于同期-18 ℃存活率(3.9%)。

本研究表明，将牛奶保存法应用于阴道加德纳菌的保存是可行的。-80 ℃牛奶保存12个月、24个月存活率分别为100.0%、92.2%。阴道加德纳菌牛奶保存法具有操作简便、成本低廉等特点，值得推广应用。

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重庆市万州区科技项目(201403045)。

10.3969/j.issn.1673-4130.2016.24.061

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1673-4130(2016)24-3521-02

2016-07-12

2016-09-28)