3D生物打印技术在脑胶质瘤研究中的应用

黄 庆，康慧斌，张洪兵

（首都医科大学附属北京潞河医院神经外科，北京101149）

3D生物打印技术在脑胶质瘤研究中的应用

黄 庆，康慧斌，张洪兵

（首都医科大学附属北京潞河医院神经外科，北京101149）

3D生物打印技术是近期在国内外兴起的一项新的研究技术，已经运用到多个医学相关领域.脑胶质瘤是最常见的颅内肿瘤之一，该病具有易复发、预后差的特点，目前仍有许多研究的瓶颈问题和关键点难以克服.3D生物打印技术在脑胶质瘤研究中的应用还处于初期探索阶段，主要集中在肿瘤模型制作并检测肿瘤细胞对各种抗肿瘤药物敏感性和耐药性等方面.本文就近期3D生物打印技术在脑胶质瘤研究领域的应用情况做了初步回顾，并就其发展前景进行了展望.

3D生物打印；脑胶质瘤；应用

1 脑胶质瘤的流行病学与研究难点

脑胶质瘤是最常见的颅内肿瘤之一，据四川大学华西医院王翔等［1］统计，2008～2013年在我国四川省各大医院收治的中枢神经系统肿瘤中，神经上皮来源的肿瘤是第一大类肿瘤，占全部中枢神经系统肿瘤的近1／3，其中，胶质母细胞瘤占第一位（38.14%），其次分别为弥漫性星形细胞瘤（15.21%），间变性星形细胞瘤（8.83%），以及毛细胞型星形细胞瘤（6.57%）等.另据美国脑肿瘤注册中心（CBTRUS）统计显示［2］，2009～2013年美国40岁以上人群中，中枢神经系统肿瘤年发病率为40.10人／每10万人，年死亡率为8.89人／每10万人，其中，最常见的颅内恶性肿瘤为胶质母细胞瘤（46.6%），而在19岁以下脑肿瘤患者中，其发生率可高达47.4%.该病发病率、死亡率高，治愈率低，具有高度异质性，常为浸润性生长，边界不清，治疗后常常复发，术后生存期较短，胶质母细胞瘤5年存活率仅为5.5%，接受标准化治疗的患者中位生存期仅为14.6个月，低级别胶质瘤虽然生长缓慢，但有易复发和向高级别进展的可能，患者生存期3～5年不等.该病易复发、预后差的难题仍未完全攻克，这主要是由于胶质瘤呈浸润式生长，难以全部切除，而血脑屏障阻碍了大部分药物进入肿瘤局部发挥作用的结果.因此，深入分析胶质瘤的生物学特性，精准地给予肿瘤定位及相应治疗是当前脑胶质瘤研究的热点和难点.

2 脑胶质瘤研究的新技术

近十年来，胶质瘤的诊断和治疗技术得到很大的发展，产生了包括纳米技术［3］、免疫治疗技术［4］、3D打印技术［5］、靶向治疗技术［6］等在内的许多新技术，其中，3D打印技术越来越受到国内外学者的重视.

3D打印技术是目前国际上发展最迅猛的几项新兴技术之一，被认为是引领“第四次工业革命”的最强推动力［7－8］.近年来，该技术在医学领域的应用越来越深入，在生物组织打印、器官模型制作等方面发展迅速，已有神经外科、心脏外科、骨科、肝胆外科、泌尿外科等开始研究制作器官三维立体模型辅助诊断与治疗，比如：美国国家医疗中心专家应用该技术成功构建了先天性心脏病患者的心脏模型，外科医生利用此模型在术前对患者复杂的心脏结构进行深入的模拟分析，美国密歇根大学医学院研究人员利用该技术3D打印了支气管支架，并获得了美国食品药物管理局（FDA）批准，成功为1名先天性支气管软化症患儿移植了3D打印支气管支架，近期还有成功打印椎间盘、主动脉瘤、脑动脉瘤等组织器官3D模型的报道［9－12］.在脑胶质瘤研究领域，王振等［13］报道了应用3D打印技术治疗包括胶质瘤在内的3例脑干肿瘤的临床研究报告，他们在术前对患者行头部CTA和MRI检查，然后把数据导入Mimics软件中进行3D模型重建，围绕术区构建患者肿瘤组织、颅骨、临近区域的血管，并以此为基础设计手术入路，为术者提供了立体直观的术前评估手段，增加了手术的安全性.

而3D生物打印技术则是在常规3D打印模型的基础上应用3D生物打印机制作出含有细胞成分并具有生物学活性的产品，该技术的核心是生物砖，即一种新型的、精准的、具有仿生功能的干细胞培养体系，它是以种子细胞（干细胞、已分化细胞等）、生长因子和营养成分等多组份组成的“生物墨汁”，再结合其他材料层层打印出的产品，经打印后培育处理，形成具有生理功能的组织结构［5，13－15］.提出细胞和器官3D打印的“概念之父”是美国克莱姆森大学托马斯·波兰教授，他指导自己的博士生、清华大学的徐弢教授通过3D打印技术利用心肌细胞和特定的生物材料成功打印出一颗能够有节奏地跳动的心脏；美国韦克福雷斯特大学团队近期利用3D生物打印技术复制出人造耳朵、骨骼、肌肉等组织器官，成功移植到动物体内并保持了生物活性；四川大学华西医院康裕建教授团队采用动物自体的脂肪源性间充质干细胞制备出个体化的3D生物打印墨汁，在自主研发的3D生物血管打印机上成功复制出具有生物活性的恒河猴自体血管，将该血管通过手术移植到动物体内，实现了血管的再生.

目前，3D生物打印技术在脑胶质瘤研究中的应用还处于初期探索阶段，主要集中在肿瘤模型制作并检测肿瘤细胞对各种抗肿瘤药物敏感性和耐药性等方面［16］.脑胶质瘤模型的制作对于探讨该病发生、发展的机制，建立新的治疗手段，促进临床研究的深入发展都极为重要.理想的胶质瘤模型应该具备以下几个生物学特性和化学特性［17］，即肿瘤的形态学特征具有高度一致性，各代的移植瘤与初代接种的肿瘤细胞在形态学、核分裂相、肿瘤间质和血管等结构上高度近似；肿瘤的遗传学特征具有高度一致性，传代移植的肿瘤细胞染色体与初代接种的肿瘤细胞染色体要高度近似；肿瘤细胞的增殖动力学特征具有高度一致性，各代移植瘤细胞在细胞周期、时相比例、分裂指数和倍增时间等方面要高度近似；肿瘤的标记物具有高度一致性，移植瘤与初代接种的肿瘤细胞应在一些胶质瘤特有生化指标的定性或定量方面保持高度近似；驻瘤模型应具有高度稳定性，肿瘤细胞经过多次连续培养传代后，细胞存活率与移植成功率高，无自然消退等现象.

近年来，国内外学者采用多种方式制作了不同的脑胶质瘤模型，其中包括：大鼠／小鼠脑胶质瘤（C6、9L、T9和F98等细胞株）模型、裸鼠脑胶质瘤原位（U87R细胞株）模型、斑马鱼原位胶质瘤（U87R细胞株）模型、低级别脑胶质瘤组织块法原代培养（IDH 1／2突变型胶质瘤细胞株）等［18－20］，但上述模型仍不能很好地模拟胶质瘤的生物学特性，其中很重要的一个因素即目前绝大多数的研究层面为二维空间，对于肿瘤细胞的空间分布及其相互作用不能完整体现，不能很好地在体或体外构建胶质瘤生物模型，因此，3D生物打印技术被引入脑胶质瘤模型研究之中.

3 3D生物打印技术在脑胶质瘤研究中的初步应用

通过基于细胞和组织的3D生物打印技术目前主要采用携带细胞的水凝胶3D沉积技术，直接携带细胞打印这种技术相比于以往在已成型的支架中种植细胞，可以获得更高的细胞存活率和细胞密度.Dai等［16］近期采用3D生物打印方式成功将胶质母细胞瘤干细胞培养放置在明胶／海藻酸／纤维蛋白原水凝胶的基质构建的模型中，发现3D生物打印细胞培养模式下的胶质瘤干细胞存活率为86.92%，这些肿瘤细胞保留了原有的遗传学特点，还能够表达出细胞特异性的分子标记，如血管生成因子VEGF，同时具有较高的细胞增殖活性，3D生物打印培养模式的胶质瘤干细胞较2D培养模式具有更强的耐药性.Loess⁃ner等［21］也成功运用水凝胶材料做为细胞外基质，在体外将肿瘤细胞构建成三维模式.不过，由于胶质瘤生物模型中存在细胞⁃细胞间、细胞⁃基质间、时间与空间、代谢梯度、机械阻力等多种因素的相互作用，应用3D生物打印技术复制脑胶质瘤模型仍有许多亟待解决的问题，包括：具有多喷头的3D生物打印机的研发、作为3D打印基质的新一代成型材料的探索、肿瘤打印核心区域细胞存活率的保持、细胞生物孵化器的改进等.

4 3D生物打印技术的制约因素与发展展望

3D生物打印机是进行3D细胞生物打印的基础，目前国内外已经成型的该类打印机包括：瑞士RegenHU BIOFACTORY细胞生物打印机、Regenvov公司的3D生物打印工作站、新加坡Bio3D Technolo⁃gies公司的Bio3D Life⁃Printer细胞生物打印机、迈普MP⁃BIOPRINT3.0细胞生物打印机、Organovo公司的NovoGen MMXTM细胞生物打印机、蓝光英诺的3D生物血管打印机等［5，12，22］.这些打印机主要采用基于喷墨技术的生物打印工艺，具备可任意定制并自动切换的多喷头系统、多轴运动平台、多区段温度控制与压力调控等，将细胞悬液或生物材料作为生物砖（生物墨汁），通过加热或压电的方式将打印材料滴出成形，提供细胞生长所需的微环境，在一定程度上提高了3D打印细胞更高的存活率和结构与功能的稳定性，但这些设备在生物打印细胞过程中的可操控性和机械稳定性仍有待进一步提升.

作为细胞外基质的生物材料是影响3D肿瘤生物打印的关键因素之一［23］，细胞外基质形成三维多孔支架空间，提供力学支撑，使肿瘤细胞增殖、分化、迁移和粘连，促进细胞长入、基因表达.理想的生物材料应该具备良好的生物相容性、生物响应性、降解性能和力学特性等，能够满足肿瘤细胞的3D成型支撑，保证模型表面或核心的细胞具有很高的存活率，目前最常用的明胶／海藻酸／纤维蛋白原水凝胶基质可以初步满足3D细胞生物打印要求，但打印在基质中的细胞与细胞之间的联系受到一定的影响，天坛医院张东团队与我们近期共同进行的研究初步发现将干细胞打印种植于海藻酸盐基质表面较种植于该基质中具有更高的细胞存活率，提示目前常用的3D打印基质仍有很大的缺陷，尤其是该基质在模型后期的支撑性及其对钙离子的依赖性对于细胞活性的影响仍有待进一步解决，因此，寻找新的3D成型支撑材料是该模型研究的关键点之一.

肿瘤模型打印后，需要置入细胞生物孵化器中进一步培育，这种生物孵化器应高度近似于肿瘤体内生长微环境，含有各种理化成份与生长因子，由此孕育出的肿瘤模型才能够更接近体内肿瘤.美国NASA发明了一种旋转细胞培养系统，通过模拟微重力，将细胞维持在一个动态的悬液环境，获得低剪切力的培养环境，这是一种全新的体外三维细胞培养模式，该系统较静态培养和其他动态培养方式更容易使细胞分化和维持三维立体结构，有利于目标细胞聚集生长为类似体内的组织结构.而目前国内还没有产生自主知识产权的细胞生物孵化器，完全依赖于国外的同类产品.

因此，3D生物打印技术应用于脑胶质瘤的研究仍任重而道远，生物材料学的进步、细胞生物孵化器的改进、3D生物打印机的发展是其中几个制约发展的关键因素，在今后的研究中，如果能与包括纳米技术、人工智能技术、医学仿生工程技术等在内的其他新兴技术相结合，该技术将会有更广阔的发展空间.

［1］王 翔，周 桥，刘艳辉，等.2008～2013年四川省中枢神经系统肿瘤病理确诊病例统计报告［J］.中华神经外科杂志，2015，31（12）：1195－1200.

［2］Ostrom QT，Gittleman H，Fulop J，et al.CBTRUS statistical report：primary brain and central nervous system tumors diagnosed in the United States in 2008－2012［J］.Neuro Oncol，2015，17 Suppl 4：iv1－iv62.

［3］涂艳阳，祁 婧，张永生，等.胶质瘤纳米治疗技术的研究现状与发展前景［J］.转化医学电子杂志，2016，3（9）：1－4.

［4］张 倩，曹 蓓.胶质瘤的免疫治疗研究进展［J］.中华神经医学杂志，2016，15（8）：856－859.

［5］Ji S，Guvendiren M.Recent advances in bioink design for 3D bioprinting of tissues and organs［J］.Front Bioeng Biotechnol，2017，5：23.

［6］蒋建利，付之光.抗肿瘤小分子靶向药物及靶点研究进展［J］.转化医学电子杂志，2016，3（1）：5－8.

［7］Wang J，Goyanes A，Gaisford S，et al.Stereolithographic（SLA）3D printing of oral modified⁃release dosage forms［J］.Int J Pharm，2016，503（1－2）：207－212.

［8］Goyanes A，Wang J，Buanz A，et al.3d printing of medicines：engi⁃neering novel oral devices with unique design and drug release char⁃acteristics［J］.Mol Pharm，2015，12（11）：4077－4084.

［9］Ayub A，Al⁃Ayoubi AM，Bhora FY.Stents for airway strictures：selection and results［J］.J Thorac Dis，2017，9（Suppl 2）：S116－S121.

［10］Suchyta M，Mardini S.Innovations and future directions in head and neck microsurgical reconstruction［J］.Clin Plast Surg，2017，44（2）：325－344.

［11］Vukicevic M，Mosadegh B，Min JK，et al.Cardiac 3D printing and its future directions［J］.JACC Cardiovasc Imaging，2017，10（2）：171－184.

［12］Hong N，Yang GH，Lee J，et al.3D bioprinting and its in vivo applications［J］.J Biomed Mater Res B Appl Biomater，2017.

［13］王 振，孙靖驰，李靖远，等.3D打印技术在脑干肿瘤手术治疗中临床应用［J］.临床军医杂志，2017，45（2）：172－175.

［14］Datta P，Ayan B，Ozbolat IT.Bioprinting for vascular and vascular⁃ized tissue biofabrication［J］.Acta Biomater，2017，51：1－20.

［15］Patra S，Young V.A review of 3D printing techniques and the future in biofabrication of bioprinted tissue［J］.Cell Biochem Biophys，2016，74（2）：93－98.

［16］Dai X，Ma C，Lan Q，et al.3D bioprinted glioma stem cells for brain tumor model and applications of drug susceptibility［J］.Biofab⁃rication，2016，8（4）：045005.

［17］Molinaro AM，Wrensch MR，Jenkins RB，et al.Statistical consider⁃ations on prognostic models for glioma［J］.Neuro Oncol，2016，18（5）：609－623.

［18］Thompson EG，Sontheimer H.A role for ion channels in perivascular glioma invasion［J］.Eur Biophys J，2016，45（7）：635－648.

［19］Chen F，Becker A，LoTurco J.Overview of transgenic glioblastoma and oligoastrocytoma CNS models and their utility in drug discovery［J］.Curr Protoc Pharmacol，2016，72：14.37.1－12.

［20］Katakowski M，Chopp M.Exosomes as tools to suppress primary brain tumor［J］.Cell Mol Neurobiol，2016，36（3）：343－352.

［21］Loessner D，Meinert C，Kaemmerer E，et al.Functionalization，preparation and use of cell⁃laden gelatin methacryloyl⁃based hydro⁃gels as modular tissue culture platforms［J］.Nat Protoc，2016，11（4）：727－746.

［22］Zhang X，Zhang Y.Tissue engineering applications of three⁃dimen⁃sional bioprinting［J］.Cell Biochem Biophys，2015，72（3）：777－782.

［23］Zhang YS，Duchamp M，Oklu R，et al.Bioprinting the cancer micro⁃environment［J］.ACS Biomater Sci Eng，2016，2（10）：1710－1721.

Application of 3D bioprinting technology in the research of glioma

HUANG Qing，KANG Hui⁃Bin，ZHANG Hong⁃Bing
Department of Neurosurgery，Beijing Luhe Hospital，Capital Med⁃ical University，Beijing 101149，China

The technology of 3D bioprinting is a new research technique in recent years，and it has been applied to many medical fields.Glioma is one of the most common intracranial tumor，and it has the characteristics of easy recurrence and poor prognosis.There are still many bottlenecks and key points which cannot be overcomed.The application of 3D bioprinting in the study of glioma is still in the initial stage of exploration.And it mainly focuses on simulating the tumor models and detecting the sensitivity and drug resistance of the tumor cells for antineoplastic drugs.This review preliminarily focuses on the aspect of 3D bioprinting，which has been applied in the study of glioma，and provides the prospect for its development.

3D bioprinting；glioma；application

R739.41

A

2095⁃6894（2017）07⁃61⁃03

2017－05－11；接受日期：2017－05－26

首都临床特色应用研究与成果推广项目（Z171100001017044）；北京市通州区科技计划项目国自然攻坚专项（KJ2017CX039⁃10）；北京市通州区卫生发展科研专项重点课题（TWKY⁃2016⁃ZD⁃01⁃10）

黄 庆.博士，主任医师，副教授.研究方向：神经外科.E⁃mail：doctor＿huang＠163.com