茶多酚对百草枯中毒大鼠肾脏氧化应激及炎症反应的影响

沈海涛，吴娜，赵宏宇，胡晓，郭峰，赵敏

（中国医科大学附属盛京医院1.急诊科；2.内分泌科，沈阳 110004）

茶多酚对百草枯中毒大鼠肾脏氧化应激及炎症反应的影响

沈海涛1，吴娜2，赵宏宇1，胡晓1，郭峰1，赵敏1

（中国医科大学附属盛京医院1.急诊科；2.内分泌科，沈阳 110004）

目的 探讨茶多酚对百草枯中毒大鼠肾脏氧化应激及炎症反应的影响及可能机制。方法 将大鼠随机分为对照组（A组）、百草枯染毒组（B组）、百草枯染毒+小剂量茶多酚组（C组）、百草枯染毒+大剂量茶多酚组（D组），每组10只。HE染色观察肾脏组织，生化检测仪检测肌酐水平，ELISA法检测血清中8⁃异前列腺素、白细胞介素6（IL⁃6）及肿瘤坏死因子α（TNF⁃α）水平，Western blotting检测3⁃硝基酪氨酸（3⁃NT）蛋白水平，比色法检测肾脏组织氧化应激水平，实时PCR检测肾脏组织TNF⁃αmRNA及IL⁃6mRNA水平。结果 B、C、D组大鼠在百草枯染毒后均出现肾脏受损，但C、D组在茶多酚干预下肾脏损伤较B组有所改善，且大剂量茶多酚干预下的D组肾脏损伤改善更为明显。在茶多酚干预下的C、D组血清中肌酐、8⁃异前列腺素、IL⁃6及TNF⁃α水平以及肾脏组织的丙二醛、3⁃NT、TNF⁃αmRNA及IL⁃6mRNA水平较B组均降低，大剂量茶多酚干预下的D组降低更为显著。结论 茶多酚干预对百草枯中毒大鼠肾脏有保护作用，其作用机制可能与减轻肾脏中氧化应激及炎症反应有关。

茶多酚；百草枯；氧化应激；炎症反应；肾脏

百草枯是针对杂草类杀伤效果极佳的除草剂，经稀释喷洒后可以达到较强的触杀效果，并且具有在土壤催化下快速失活的特点，失活之后无毒素残留，对环境影响极小。我国一直是农业为本的大国，因此在我国性价比极高的百草枯是最为流行的除草剂。百草枯如按照指导正常使用罕见中毒反应，但一旦经口吞服则极易造成中毒。百草枯的毒性极强且无特效解毒剂，所以在临床实践中具有极高的病死率［1］。

百草枯在体内经过氧化还原反应产生大量氧自由基以及炎性细胞因子，而百草枯产生的氧自由基主要发生在线粒体基质［2］。抗氧化剂一方面可以抑制氧由基的产生，另一方面又可直接灭活氧化还原产生的氧自由基，从而减轻氧自由基损伤。深入研究氧化应激与百草枯之间的相互关系，以及各种抗氧化剂的作用机制及效果，不但有助于了解百草枯中毒的致病机制，而且将为百草枯中毒的治疗提供一个新的策略。近几年，茶叶的提取物茶多酚因其安全无污染及强大的抗氧化作用日益受到大家的青睐。茶多酚结构中的芳香环可以结合能够中和氧自由基的羟基，从而表现出强大的抗氧化能力［3］。并且茶多酚在氧化还原平衡中往往补偿过度消耗的抗氧化系统，通常作为一种高效而又低毒的自由基清除剂来维持氧化还原平衡。

本研究采用腹腔一次性注射百草枯的方式建立百草枯中毒大鼠模型，通过给予不同剂量的茶多酚来研究茶多酚对百草枯中毒大鼠肾脏的保护作用。目前研究发现茶多酚能减轻百草枯中毒大鼠的肺损伤［4⁃6］及神经损伤［7］，而对肾脏作用的动物体内研究较少。目前仅有徐丽倩等［4］在大鼠体内实验中发现茶多酚能降低百草枯中毒大鼠的肌酐，然而其机制尚未明确。本研究通过检测大鼠血清及肾脏的氧化应激及炎症反应，来探讨茶多酚改善百草枯中毒大鼠肾脏损伤的机制。

1 材料与方法

1.1 材料

百草枯标准品及茶多酚购于美国Sigma⁃Aldrich公司；8⁃异前列腺素、白细胞介素6（interleukin⁃6，IL⁃6）及肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor α，TNF⁃α）的ELISA试剂盒均购于美国Uscnlife公司；检测丙二醛（malondialdehyde，MDA）及谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH⁃Px）活性的比色法试剂盒购于中国南京建成公司；3⁃硝基酪氨酸（3⁃ni⁃trotyrosine，3⁃NT）抗体购于美国Abcam公司；β⁃actin抗体购于美国Santa Cruz公司；Trizol试剂盒、定量反转录试剂盒均购于日本TaKaRa公司。

1.2 实验方法

1.2.1 动物：清洁级SD雄性大鼠，6～8周龄，体质量200～250 g，由中国医科大学实验动物中心提供。大鼠适应性喂养1周，饲养温度控制在20～25℃，湿度控制在40%～70%，昼夜节律控制12 h，自由进食水。该实验方案经过中国医科大学动物伦理委员会批准（伦理号2015PS302K）。

1.2.2 模型构建及动物分组：将大鼠随机平均分成4组：阴性对照组（A组）、百草枯染毒组（B组）、百草枯染毒+小剂量茶多酚组（C组）、百草枯染毒+大剂量茶多酚组（D组），每组10只。A组腹腔注射等量生理盐水。B组腹腔注射20 mg/kg百草枯溶液（10 mg/mL溶于生理盐水）。C组腹腔注射20 mg/kg百草枯溶液，6 h后给予小剂量茶多酚（200 mg·kg-1·d-1）灌胃。D组腹腔注射20 mg/kg百草枯溶液，6 h后给予大剂量茶多酚（400 mg·kg-1·d-1）灌胃。

1.2.3 标本的采集及保存：百草枯腹腔注射后72 h，使用10%水合氯醛300 mg/kg腹腔麻醉。待麻醉充分后，将大鼠仰卧于鼠台上固定，常规消毒后打开胸腔，使用1 mL注射器刺入右心室，缓慢取血，避免溶血。将血放入1.5 mL离心管中，3 000 r/min、4℃离心10 min，取上清分装至1.5 mL EP管中，每管放约0.2 mL，置-80℃冰箱保存。迅速取出肾脏，生理盐水清洗后，一部分置于4%多聚甲醛中4℃固定，另一部分肾脏液氮速冻后置于-80℃冰箱保存，以备检测。

1.2.4 肾组织HE染色：取固定好的肾脏组织，脱水后石蜡包埋，连续切片后备用HE染色。载玻片APES防脱片处理，组织切片在水浴箱中充分展片后用载玻片捞取组织，行HE染色。

1.2.5 血清中肌酐、氧化应激及炎性细胞因子的测定：使用日立全自动生化分析仪检测大鼠肌酐水平；采用ELISA法检测血清中8⁃异前列腺素、IL⁃6及TNF⁃α水平，将冻存血清置于室温中解冻，按ELISA试剂盒说明书中的方法测定。

1.2.6 肾脏氧化应激的测定：采用比色法检测肾脏MDA及GSH⁃Px活性，严格按照比色法试剂盒说明书步骤进行。采用Western blotting检测肾脏3⁃NT蛋白水平，肾脏样本等量上样，凝胶电泳分离后将蛋白转移至PVDF膜上。封闭后，加入一抗3⁃NT 4℃摇床孵育过夜。加入二抗β⁃actin，用TBST冲洗，ECL显影扫描，条带灰度值以Image Pro Plus测定。

1.2.7 肾脏炎性细胞因子的测定：采用实时PCR检测肾脏组织TNF⁃α及IL⁃6mRNA水平，匀浆提取总

RNA，反转录后行实时PCR检测TNF⁃α、IL⁃6及β⁃actinmRNA，应用7500荧光定量PCR仪上的分析软件对实验结果进行分析。引物如下：IL⁃6，上游引物5’⁃TCGAGCCCACCGGGAACGAA⁃3’，下游引物5’⁃GCAACTGGACCGAAGGCGCT⁃3’；TNF⁃α，上游引物5’⁃CGAGTCTGGGCAGGTCTACTTT⁃3’，下游引物5’⁃AGAGGTTGAGGGTGTCTGAAGG⁃3’；β⁃actin，上游引物5’⁃GGAGATTACTGCCCTGGCTCCTA⁃3’，下游引物5’⁃GACTCATCGTACTCCTGCTTGCTG⁃3’。

1.3 统计学分析

数据以x±s表示，应用SPSS 16.0软件进行统计学处理，采用方差分析比较4组间差异。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肾脏组织HE染色

A组肾小球无出血，肾小管管腔清晰无渗出，未见间质水肿；B组肾小球可见出血，肾小管上皮细胞可见玻璃样变性，肾小管上皮细胞肿胀，管腔可见蛋白渗出物，间质有炎症浸润，可见出血；C组肾小球无出血，肾小管上皮细胞偶见玻璃样变性，管腔内见少许渗出，间质可见少量出血；D组肾小球无出血，肾小管上皮细胞略肿胀，管腔内无渗出，间质轻度水肿，无出血。见图1。

2.2 血清中肌酐、氧化应激及炎性细胞因子水平

图1 大鼠肾脏组织HE染色 ×40Fig.1 HE staining of rat renal tissues ×40

B组血清中肌酐及8⁃异前列腺素水平明显高于A组（P＜0.05）；C、D组与B组比较，肌酐及8⁃异前列腺素水平明显降低（P＜0.05）；D组肌酐及8⁃异前列腺素水平较C组降低（P＜0.05）。与A组相比，B组血清中TNF⁃α及IL⁃6水平升高，给予茶多酚干预后其水平降低。D组血清中IL⁃6水平较C组降低，但差异无统计学意义。D组血清中TNF⁃α水平较C组明显降低（P＜0.05）。见表1。

表1 血清中肌酐、氧化应激及炎性细胞因子水平Tab.1 Serum creatinine，oxidative stress，and inflammatory cytokines levels

2.3 肾脏组织氧化应激指标及炎性细胞因子的mRNA水平

B组肾脏组织中MDA及3⁃NT蛋白水平较A组明显升高（P＜0.05），C、D组较B组明显降低（P＜0.05），D组降低更显著（P＜0.05）。B组与A组比较GSH⁃Px活性明显降低（P＜0.05），而C、D组较B组明显升高（P＜0.05）。B组肾脏TNF⁃α及IL⁃6的mRNA水平明显高于A组（P＜0.05），C、D组较B组明显降低（P＜0.05），且D组TNF⁃α及IL⁃6的mRNA水平比C组更低（P＜0.05）。见表2。

3 讨论

本研究采用腹腔一次性注射20 mg/kg百草枯的方式建立了百草枯中毒大鼠模型。在本课题组前期研究中，分别给予大鼠腹腔一次性注射10、20、30、40及50 mg/kg的百草枯，结果发现，10 mg/kg百草枯处理的大鼠中毒率较低；20 mg/kg能获得满意的中毒率而死亡率极低；30、40及50 mg/kg百草枯处理后的大鼠虽然中毒率较高，但死亡率也较高［8］。因此在本研究给予大鼠20 mg/kg百草枯一次性腹腔注射来建立大鼠中毒模型。结果发现200和400 mg·kg-1·d-1的茶多酚干预均使百草枯中毒大鼠的肌酐降低。同时，茶多酚的干预减轻了大鼠血清中氧化应激及炎症反应，也减轻了肾脏中的炎症反应及氧化应激。

表2 肾脏组织中氧化应激指标及炎性细胞因子的mRNA水平Tab.2 Oxidative stress indicator and mRNA level of inflammatory cytokines in renal tissue

本研究发现，茶多酚的干预使百草枯引起的肾脏损害明显改善，这与徐丽倩等［4］的研究一致。本研究还发现百草枯中毒大鼠给予大剂量茶多酚后，其肌酐水平比给予小剂量茶多酚更低。这说明茶多酚干预对百草枯中毒大鼠肾脏有保护作用，并且在一定浓度范围内这种保护作用随剂量的增加而增强。茶多酚改善百草枯大鼠肾损伤安全有效的剂量范围及具体机制仍需要进一步的研究。

目前认为，百草枯的中毒机制与氧化还原反应失衡及细胞内氧化应激有关［9］。氧化应激作为机体修复系统机能过程中产生的活性氧簇和活性氮簇造成的氧化损伤，是正常氧化还原反应中的主要应激反应。百草枯所致的靶器官损伤依赖于氧化还原失衡，肺作为氧浓度最高的部位而成为最容易受累的器官。但近年发现，急性肾损伤也是百草枯中毒患者的常见死因［10⁃11］。百草枯中毒后主要通过肾脏清除，肾脏是除肺组织外百草枯浓度最高的器官，因此急性肾损伤是百草枯中毒常见的并发症，本研究中腹腔注射20 mg/kg的茶多酚即造成了大鼠急性肾损伤。为了评估血清中氧化应激水平，本研究采用了8⁃异前列腺素，8⁃异前列腺素是体现不饱和脂肪酸被自由基催化而脂质过氧化后的氧化反应终产物，因为其产生机制及过程与过氧化损伤息息相关，故而近年来人们经常使用其来研究和评估过氧化损伤［12］。本研究发现茶多酚减轻了百草枯中毒大鼠血清中的氧化应激和炎症反应，这与既往研究一致［4⁃6］。既往研究［13］发现百草枯中毒大鼠的肾脏氧化应激及炎症反应增强，茶多酚能减轻百草枯中毒引起的肺脏氧化应激［5⁃6］。而茶多酚能否减轻肾脏的氧化应激及炎症反应尚未见报道。本研究发现茶多酚能降低肾脏IL⁃6及TNF⁃αmRNA水平，降低肾脏3⁃NT蛋白水平。说明茶多酚可能是通过减轻肾脏中氧化应激及炎症反应来降低百草枯引起的急性肾损伤。

茶多酚是从茶叶中提取的含有多酚类化合物的混合物。研究表明，茶多酚具有抗菌、防癌抗癌、降血脂、保护心脑血管、护肝和抗氧化等作用［4，14⁃15］。我国是茶叶生产大国，茶叶资源非常丰富。充分而有效地利用这一资源优势，深度开发优质的医用茶多酚产品，其经济效益十分显著。随着人们对氧化应激及抗氧化剂认识的不断深入，茶多酚等安全高效的抗氧化剂有望成为百草枯中毒治疗中一项新的策略。

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（编辑 陈 姜）

Effects of Epigallocatechin⁃3⁃gallate on Oxidative Stress and Inflammatory Factors in the Kidney Tissues of Rats with Paraquat Poisoning

SHEN Haitao1，WU Na2，ZHAO Hongyu1，HU Xiao1，GUO Feng1，ZHAO Min1
（1.Department of Emergency，Shengjing Hospital，China Medical University，Shenyang 110004，China；2.Department of Endocrinology，Shengjing Hospital，China Medical University，Shenyang 110004，China）

Objective To investigate the effect of Epigallocatechin⁃3⁃gallate（EGCG）on oxidative stress and inflammatory factors in the kidney tissues of rats with paraquat poisoning，and explore the possible mechanism.Methods Rats were randomly divided into control group（group A），paraquat exposure group（group B），paraquat exposure+low dose of EGCG group（group C），and paraquat exposure+high dose of EGCG group（group D）（n=10 in each group）.Kidney tissues were harvested and observed by HE staining.The level of creatinine was tested by biochemical detector.Serum oxidative stress and inflammatory factor level were detected by ELISA method.Oxidative stress in kidney tissue was determined by Western blotting and colorimetry.Inflammatory factor level in renal tissue was tested by real⁃time PCR.Results Kidney damage was observed in rats of groups B，C，and D.Rats in groups C and D showed less renal injury than group B，and high dose of EGCG（group D）enhanced kidney damage compared to the low dose（group C）.Compared with group A，rats in the groups C and D showed lower level of 8⁃isoprostane，creatinine，interleukin⁃6（IL⁃6），and tumor necrosis factor α（TNF⁃α）in serum and malondialdehyde（MDA），3⁃nitrotyrosine（3⁃NT），andTNF⁃αandIL⁃6 mRNA in renal tissue in rats with paraquat poisoning，and group D showed the lowest mRNA level of inflammatory factor and oxidative stress.Con⁃clusion EGCG has protective effects on the kidney of rats with paraquat poisoning，and its mechanism may be related to the reduction of oxida⁃tive stress and inflammatory reaction in the kidney.

epigallocatechin⁃3⁃gallate；paraquat；oxidative stress；inflammatory reaction；kidney

R595.4

A

0258-4646（2017）03-0210-05

10.12007/j.issn.0258⁃4646.2017.03.005

卫生部国家临床重点专科建设项目（2012⁃649）

沈海涛（1980-），男，主治医师，硕士.

赵敏，E-mail：zhaom@sj⁃hospital.org

2016-09-14

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