结核性胸膜炎模型大鼠胸腔积液MMP-1和TIMP-1表达

陈 刚 徐旭东 叶 波 喻国灿

结核性胸膜炎模型大鼠胸腔积液MMP-1和TIMP-1表达

陈 刚 徐旭东 叶 波 喻国灿

目的 探讨基质金属蛋白酶1（MMP-1）及其组织抑制物1（TIMP-1）在结核性胸膜炎胸腔积液不同阶段的作用。方法Wistar雄性大鼠60只，将人型结核菌株H37Rv注入50只实验组大鼠右侧胸腔内，另10只对照组大鼠同侧胸腔注入纯化蛋白衍生物（PPD）原液，注入后第1、3、7、15、30天分批处死大鼠，解剖胸腔，记录胸腔积液量，观察两组大鼠胸腔、胸膜和肺组织大体及镜下病理变化，采用酶联免疫吸附试验（ELISA）法测定两组大鼠胸腔积液中MMP-1和TIMP-1浓度。结果对照组大鼠在注入第1天时胸腔积液量为1.3mL，不能进行MMP-1和TIMP-1有效常规检测，第3天后完全吸收。实验组大鼠15天内均有右侧胸腔积液，第1、3、7、15天胸腔积液量分别为（4.9±0.5）mL、（6.3±0.4）mL、（7.2±0.6）mL、（2.5±0.3）mL，第7天最多；胸腔积液中MMP-1和TIMP-1浓度分别为（9.54±0.97）ng/mL和（27.06±2.61）ng/mL、（15.62±1.30）ng/mL和（35.68±2.70）ng/mL、（29.78±1.97）ng/mL和（40.07±3.61）ng/mL、（35.12±2.13）ng/mL和（42.15±3.08）ng/mL，均呈逐渐升高趋势。结论结核性胸膜炎早期局部免疫反应以持续增强为主，MMP-1、TIMP-1在此过程中发挥作用。

大鼠；结核性胸膜炎；基质金属蛋白酶1；基质金属蛋白酶组织抑制物1

结核性胸膜炎是胸膜对结核杆菌及其代谢产物高度变态反应时产生的胸膜炎症，基质金属蛋白酶及其组织抑制物在结核杆菌感染后的细胞招募、组织重塑和破坏中发挥重要作用[1]，本研究通过检测结核性胸膜炎大鼠胸腔积液中基质金属蛋白酶（MMP-1）及其组织抑制物（TIMP-1）浓度变化，探讨其在结核性胸膜炎早期胸腔积液形成以及胸膜组织修复与重塑等不同阶段中的作用。

1 实验材料

1.1 动物及药品 Wistar雄性大鼠60只，体质量250～300g，由浙江省医学科学院实验动物中心提供，清洁二级，动物合格证号：SCXK（浙）2008-0033。饲养观察5天后在大鼠右侧腹股沟内侧备皮、消毒，卡介苗（BCG）悬液0.1mL（0.06mg）皮内注射。BCG为成都生物制品研究所有限公司生产，批号201209a055。

1.2 结核分支杆菌菌株制备 用我院结核中心实验室传代的标准人型结核菌株H37Rv在罗氏培养基上培养3周，刮取菌落，称重，研磨匀浆后用生理盐水稀释制成每毫升含菌量0.03mg的悬液备用。

2 实验方法

2.1 模型制备 60只大鼠分为实验组50只，对照组10只，均于BCG接种5周后行胸腔穿刺术：先胸部备皮，用地西泮注射液0.3mL/只肌肉注射，5min后以5号针头从右侧肋弓角顶点紧贴剑突侧缘进针约0.5cm后行胸腔穿刺；实验组50只大鼠胸腔分别注入结核分支杆菌悬液1mL，对照组10只大鼠胸腔分别注入纯化蛋白衍生物（PPD）原液1mL，以第2天顺利抽出胸腔积液为模型建立成功；实验组大鼠分别于胸腔注射后第1、3、7、15、30天分批处死各10只，行胸腔大体及病理学观察，同时每只大鼠分别取胸腔积液2mL/只备检。对照组大鼠分别于胸腔注射后第1、3、7、15、30天分批处死各2只，行胸腔大体及病理学观察。

2.2 标本采集 每只大鼠肌肉注射地西泮溶液0.4mL，从剑突处沿胸骨剪开皮肤和胸骨，暴露纵膈和胸腔，观察胸腔积液在胸内的分布，收集、记录胸腔积液量，观察胸腔内胸膜粘连程度，分别取壁、脏层胸膜和肺组织标本，并固定于10%中性甲醛溶液中。

2.3 检测指标及方法

2.3.1 胸腔积液检测 采用ELISA法测定各组大鼠胸腔积液中MMP-1、TIMP-1的浓度。MMP-1、TIMP-1酶联免疫检测试剂盒为武汉云克隆科技股份有效公司产品，规格：96T，批号20110920。

2.3.2 组织学观察 采用常规石蜡包埋、苏木精-伊红（HE）及抗酸染色方法，镜下观察组织病理改变。

2.4 统计学方法 应用SPSS23.0统计软件进行数据处理，计量资料组间比较采用独立样本t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

3 实验结果

3.1 两组大鼠胸腔大体观察及胸膜病理检查 全部大鼠经实验处理后在观察期内无一只死亡。实验组：第1天：胸腔内大量淡黄色胸腔积液，病理检查可见胸膜下和肺间质血管明显扩张，充血，脏层胸膜下有大量中性粒细胞浸润；第3天：胸腔积液内可见纤维蛋白凝块，病理检查见脏层胸膜下浸润的淋巴细胞数量增多，可见少量的上皮样细胞及灶性坏死灶，抗酸染色见大量抗酸杆菌；第7天：胸腔内见粘连带形成，质脆易剥，胸膜可见散在糜烂灶，病理检查见脏、壁层胸膜下及肺间质以淋巴细胞浸润为主，可见明显的上皮样细胞团及凝固性坏死；第15天：胸腔积液明显减少，胸膜增厚，可见粟粒大小黄色结节，病理检查见胸膜炎症减退，脏、壁层胸膜见大量的上皮样细胞团和大片干酪样坏死组织；第30天：胸腔广泛粘连，胸膜增厚不易剥离，病理检查见胸膜明显增厚，炎症细胞减少，可见大量上皮细胞团及干酪样坏死，肺间质纤维组织增生。对照组大鼠胸腔及胸膜病检无明显异常。见图1（封四）。

3.2 两组大鼠胸腔积液MMP-1、TIMP-1检测 实验组大鼠胸腔内注入结核分支杆菌悬液后第1、3、7、15天胸腔积液量分别为（4.9±0.5）mL、（6.3±0.4）mL、（7.2±0.6）mL、（2.5±0.3）mL；显示第1天即出现胸腔积液。此后胸腔积液量逐日增多，第7天达到高峰，此后下降，30天时无胸腔积液，胸腔积液中MMP-1和TIMP-1的浓度呈持续升高趋势，见表1。对照组，第1天时胸腔积液量为1.3mL，因量少无法行MMP-1、TIMP-1浓度检测，第3天时胸腔积液完全吸收。

4 讨论

胸膜中炎性细胞的浸润、增生、坏死，以及胸腔积液中纤维蛋白凝块和粘连带的形成和转归是结核性胸膜炎发展过程中的重要环节。基质金属蛋白酶及其组织抑制物在结核性胸膜炎发展中起着重要作用[2]，国内有研究者发现，结核性胸膜炎患者胸水中MMP-1、TIMP-1浓度明显高于恶性胸腔积液组，并存在一定鉴别诊断价值[3]。

MMP-1存在于类上皮组织细胞、朗罕氏巨细胞、淋巴细胞、巨噬细胞以及肉芽肿性反应的成纤维细胞中，在结核分支杆菌感染后的巨噬细胞聚集、肉芽肿形成、基质胶原破坏以及肺与胸膜的纤维化中发挥重要作用[4-6]。研究发现，结核杆菌感染早期MMP-1出现上调，后期转而出现下调，肉芽肿反应的程序发生逆转，由初始组织的破坏性炎症反应转变为抗炎反应，从而通过纤维化和愈合来减少组织破坏[7]，在抗结核治疗后痰液中的MMP-1浓度也明显降低[8]。本研究显示，结核性胸膜炎发展过程中大鼠胸腔积液中MMP-1浓度呈持续升高状态，提示大鼠胸腔结核杆菌感染早期即出现明显白细胞聚集等炎症反应，随后MMP-1浓度的持续升高可能与胸腔白细胞继续增多、结核杆菌增殖、肉芽肿形成、干酪样坏死等相关，第15天时MMP-1浓度仍持续升高，可能与期间胸膜肉芽肿形成、干酪样坏死继续加重以及胸腔积液中纤维条索形成增多相关。

表1 结核性胸膜炎模型大鼠胸腔积液MMP-1、TIMP-1浓度及MMP-1/TIMP-1比值（ng/mL，±s）

表1 结核性胸膜炎模型大鼠胸腔积液MMP-1、TIMP-1浓度及MMP-1/TIMP-1比值（ng/mL，±s）

注：与前一时间点比较，*P＜0.05；MMP-1：基质金属蛋白酶-1；TIMP-1：基质金属蛋白酶组织抑制物-1

检测指标MMP-1 TIMP-1 MMP-1/TIMP-1只数10 10 10第1天9.54±0.97 27.06±2.61 0.35±0.009第3天15.62±1.30* 35.68±2.70* 0.44±0.018*第7天29.78±1.97* 40.07±3.61* 0.75±0.021*第15天35.12±2.13* 42.15±3.08 0.83±0.011*

TIMP是多种MMP的天然特异性抑制因子，与激活的胶原酶、明胶酶等结合成复合体，从而发挥抑制作用，在正常生理状态下，MMPs与TIMPs维持相对动态平衡状态；本研究中实验组大鼠胸水MMP-1/ TIMP-1比值亦呈逐渐升高趋势，提示大鼠胸腔局部存在MMP-1/TIMP-1动态平衡破坏，与MMP-1相关的免疫反应呈总体增强趋势，在结核性胸膜炎胸膜腔局部炎症反应、组织破坏与修复中发挥着重要作用。此外，还有研究发现胸腔积液中TIMP-1水平升高与结核性胸膜炎残留胸膜增厚相关[9]；参照结核性胸膜炎不同时期胸腔大体及病理学观察，我们发现，与胸水中MMP-1浓度逐渐升高相伴随的是脏壁层胸膜增厚、干酪样坏死以及胸水中纤维条索分隔、粘连的不断加重，因此胸水中MMP-1水平或可成为结核性胸膜炎病情严重程度的间接参考指标；同时，以MMP-1活性和信号通路为目标的免疫治疗，或可延缓病情进展，成为结核性胸膜炎标准抗结核治疗外的一种辅助治疗。

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（收稿：2016-04-09 修回：2016-08-10）

Expression of MMP-1 and TIMP-1 in Pleural Effussion in Tuberculous Pleurisy Rats

CHEN Gang,XU Xudong,YE Bo,YU Guocan. Department of Tuberculosis Surgery,Zhejiang Provincial Tuberculosis Treatment Center,Zhejiang TCM and Western Medicine Integrated Hospital,Hangzhou(310003),China

Objective To investigate the effects of matrix metalloproteinase-1（MMP-1）and tissue inhibitors of met alloproteinase（TIMP-1）in the process of development of tuberculous pleurisy in rats.MethodsFifty male Wistar rats that were injected into the right pleural cavity with H37Rv of mycobacterium tuberculosis,were set as the experimental group.Another 10 rats that were injected with 1 mL purified protein derivative（PPD）solution,served as control group.The rats were were killed in batches on Day 1,Day 3,Day 7,Day 15 and Day 30 after injection,then the chest were dissected to record the amount of pleural effusion and to observe the morphological and pathological changes of pleural and lung.MMP-1 and TIMP-1 concentrations in pleural effusion of each rat were measured by enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA）method.ResultsThe amount of pleural effusion in control group was 1.3 mL on Day 1 after injection of PPD solution,which made control rats not eligible for routine;pleural effusion completely absorbed on Day 3.The rats of experimental group had pleural effusion in the right pleural cavity within the first 15 days and the amount of pleural effusion on Day 1,Day 3,Day 7 and Day 15 were as follows:4.9±0.5mL, 6.3±0.4mL,7.2±0.6mL,2.5±0.3mL,the maximum amount was on Day 7;the concentrations of MMP-1 and TIMP-1 in pleural effusion were as follows:9.54±0.97ng/mL and 27.06±2.61ng/mL,15.62±1.30ng/mL and 35.68±2.70ng/mL,29.78± 1.97ng/mL and 40.07±3.61ng/mL,35.12±2.13ng/mL and 42.15±3.08ng/mL,both of which showed a gradually increasing trend.ConclusionThe local immune response is increasing at early stage of tuberculous pleurisy.TIMP-1 and MMP-1 play a role in a series of processes,including the local inflammatory response,tissue necrosis and repair in the thoracic cavity.

rats;tuberculous pleurisy;matrix metalloproteinase-1;tissue inhibitors of metalloproteinase

杭州市医药卫生科技计划项目（No.2012B010）

浙江省中西医结合医院（浙江省结核病治疗中心）结核外科（杭州310003）

陈刚，Tel：15857106949；E-mail：cgang06@sina.com