成都市人乳头瘤病毒16型感染与宫颈病变的相关性分析

简洁，梁开如，余绍兰，王青青，易晓恋，赵清平，石艳艳，谢成彬，夏春，高丽丽，罗娜，左凤琼，李婉宜

1. 四川大学华西基础医学与法医学院微生物学教研室，成都 610041； 2. 四川省妇幼保健院妇女保健科，成都 610031； 3. 四川省妇幼保健院检验科，成都 610031； 4. 四川省妇幼保健院妇科，成都 610031； 5. 四川省妇幼保健院病理科，成都 610031； 6. 四川大学华西基础医学与法医学院免疫学教研室，成都 610041

·论著·

成都市人乳头瘤病毒16型感染与宫颈病变的相关性分析

简洁1，梁开如2，余绍兰5，王青青5，易晓恋5，赵清平4，石艳艳3，谢成彬3，夏春4，高丽丽4，罗娜4，左凤琼6，李婉宜1

1. 四川大学华西基础医学与法医学院微生物学教研室，成都 610041； 2. 四川省妇幼保健院妇女保健科，成都 610031； 3. 四川省妇幼保健院检验科，成都 610031； 4. 四川省妇幼保健院妇科，成都 610031； 5. 四川省妇幼保健院病理科，成都 610031； 6. 四川大学华西基础医学与法医学院免疫学教研室，成都 610041

本研究旨在探讨人乳头瘤病毒(human papillomavirus，HPV)16感染与宫颈病变的关系，为宫颈癌防治提供科学依据。通过核酸杂交法进行HPV感染分型，纳入1 057例HPV阳性且行组织切片病理学检查的患者，对各级别宫颈病变中HPV16构成比、不同年龄组HPV16阳性患者中宫颈上皮内瘤样病变(cervical intraepithelial neoplasia，CIN)Ⅱ及以上病变的患病率，以及HPV16单一与多重感染患者中CIN Ⅱ及以上病变的患病率进行分析。结果显示，在1 057例HPV阳性患者中，352例感染HPV16，CIN Ⅲ中HPV16构成比最高，各级别病变中HPV16构成比差异有统计学意义。随着病变级别增加，HPV16构成比有增高趋势(P<0.05)。不同年龄组HPV16阳性患者中CIN Ⅱ及以上病变的患病率差异有统计学意义(P<0.05)，且随年龄增加而升高(P<0.05)。HPV16单一、双重与三重以上感染患者中，CIN Ⅱ及以上病变的患病率差异有统计学意义(P<0.05)，且随着感染型别种类增加，患病率降低(P<0.05)。本研究显示，HPV16与高级别宫颈病变有较明显的相关性，老年HPV16阳性患者检出宫颈癌的概率更高。因此，应高度重视HPV16持续性感染，做到及时诊断与治疗，以减少宫颈高级别病变和宫颈癌的发生。

人乳头瘤病毒16；患病率；年龄；多重感染

宫颈癌是常见的女性恶性肿瘤，也是发病率最高的女性生殖道恶性肿瘤之一。在我国，每年被诊断为宫颈癌的病例约7.5万，其中44%死亡[1]。大量流行病学及分子生物学资料证实，人乳头瘤病毒(human papillomavirus，HPV)感染为宫颈癌前病变和宫颈癌发生的必要条件[2]，特别是高危型HPV，其为宫颈癌重要的致病因子。有资料显示，宫颈癌患者中HPV检出率为99.7%，其中感染率最高的亚型为HPV16[3]。本研究根据病理诊断结果，对HPV16感染情况与宫颈病变进行相关性分析，以探讨HPV16感染在宫颈病变中的意义。

1 材料与方法

1.1 一般资料

所有HPV阳性女性患者均为2013年1月—2015年12月于四川省妇幼保健院宫颈门诊就诊或行宫颈癌机会性筛查的人群，年龄16～76岁，共1 057例。 根据宫颈病理组织学检查结果，将入选患者分为5组：宫颈炎组658例、宫颈上皮内瘤样病变(cervical intraepithelial neoplasia，CIN)Ⅰ组128例、CIN Ⅱ组200例、CIN Ⅲ组26例、宫颈癌组45例。

1.2 标本收集与处理

将取材器插入子宫颈口1～1.5 cm，沿同一方向旋转3圈取出并折断刷头，然后放入标有患者编号且已加细胞保存液的取样管中，拧紧瓶盖，保存刷头于瓶中并充分振荡。

1.3 主要仪器与试剂

DNA提取试剂盒、HPV分型检测试剂盒购自潮州凯普生物化学有限公司。对21种HPV基因型进行分型检测，包括16、18、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68共15种高危型，以及6、11、42、43、44、CP8340(81)共6种低危型。聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)仪为博日公司产品，医用核酸分子快速杂交仪(凯普HHM-2)为广东凯普生物科技股份有限公司产品。

1.4 实验方法

核酸杂交实验主要包括DNA提取、PCR扩增、杂交及显色，均按试剂盒说明书操作。①DNA提取：用细胞裂解液提取DNA，保存于4 ℃冰箱备用。②PCR扩增：总体积为25 μL，包括23.25 μL PCR混合液(含引物)、0.75 μL DNA聚合酶、待测模板DNA 1 μL。同时设置阴性、阳性对照。③杂交及显色：向杂交孔内加入1 mL杂交液〔NaCl、十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate，SDS)〕，温育后排出；将0.5 mL杂交液与冰水浴处理后的20 μL PCR产物混匀，加至Biodyne C膜(氨基化探针)，温育10 min后进行导流杂交；最后用杂交液冲洗膜。整个过程需在45 ℃条件下进行，杂交液需预热至45 ℃。杂交结束后用NBT/BCIP显色。

1.5 结果判断

观察导流杂交膜上的内对照点、Biotin点、阳性对照点、阴性对照点及各杂交点，相应位点出现清晰可见的蓝紫色圆点即判断为阳性点。导流杂交膜上内对照点、Biotin点及设置的阳性对照点必须为阳性结果，阴性对照必须不显色。然后，根据试剂盒提供的HPV分型分布图判断HPV型别。如果有1个或1个以上HPV分型点为阳性，代表该型别HPV检测阳性，结果为单一或混合感染。如果HPV分型点均为阴性，则判定HPV检测阴性。

1.6 统计方法

采用SPSS 16.0软件进行统计分析，χ2检验，P<0.05为有统计学差异。

2 结果

2.1 目标人群HPV16感染情况

HPV16在不同病变级别HPV阳性患者中的构成比见表1。HPV16总构成比为33.30%，在CIN Ⅲ中构成比最高(73.08%)，CINⅠ中构成比最低(19.53%)，各级病变HPV16的构成比差异有统计学意义(χ2=125.59，P<0.05)；且随着疾病级别增加，HPV16构成比有明显增高趋势(趋势性χ2=102.85，P<0.05)。

表1 各级宫颈病变中HPV16构成比

Tab.1 The proportion of HPV16 in different cervical diseases

GroupnHPV16nProportionCervicitis65816424.92%CINⅠ1282519.53%CINⅡ20011256.00%CINⅢ261973.08%Cervicalcaner453271.11%Total105735233.30%

2.2 不同年龄组HPV16感染者中宫颈病变情况

不同年龄组HPV16感染者中CIN Ⅱ及以上病变(包括CIN Ⅱ、CIN Ⅲ及宫颈癌)情况见表2。结果表明，不同年龄组之间HPV16感染者中CIN Ⅱ及以上病变的患病率差异有统计学意义(χ2=7.78，P<0.05)；且随着年龄增加，HPV16感染者中CIN Ⅱ及以上病变的患病率有增加趋势(线性趋势χ2=5.52，P<0.05)。

2.3 HPV16单一及多重感染者中宫颈病变情况

在HPV16阳性者的各级宫颈病变中，均以单一HPV16感染为主。在宫颈癌患者中，84.38%为HPV16单一感染，未见三重及以上多重感染，单一感染在各级病变中的构成比差异有统计学意义(χ2=18.18，P<0.05)。随着病变级别增加，单一感染构成比有增加趋势(趋势性χ2=10.26，P<0.05)。各级病变的双重感染构成比差异有统计学意义(χ2=10.75，P<0.05)，在CIN Ⅰ中构成比最大。各级宫颈病变中单一及多重感染情况详见表3。

表2 不同年龄组HPV16感染者中CIN Ⅱ及以上病变的患病率

Tab.2 The prevalence of HPV16 infection in the patients with CIN Ⅱand higher diseases in different age groups

Agegroup(year)nCINⅡandhigherdiseasesnPrevalence<301083835.19%30-5020810751.44%>50361850.00%Total35216346.31%

表3 各级宫颈病变中HPV单一及多重感染情况

Tab.3 Simple and multiple infections of HPV in different cervical diseases

GroupSimpleHPVsubtype(%)TwoHPVsubtypes(%)ThreeandmoreHPVsubtypes(%)Cervicitis100(60.98%)42(25.61%)22(13.41%)CINⅠ12(48.00%)10(40.00%)3(12.00%)CINⅡ88(78.57%)16(14.29%)8(7.14%)CINⅢ12(63.16%)5(26.32%)2(10.53%)Cervical caner27(84.38%)5(15.63%)0(0)

CIN Ⅱ及以上病变患者中HPV16单一及多重感染情况见表4。结果显示，CIN Ⅱ及以上病变患者中HPV16单一与多重感染率差异有统计学意义(χ2=14.19，P<0.05)。随着HPV感染型别种类增加，CIN Ⅱ及以上病变的患病率有降低趋势(趋势性χ2=13.07，P<0.05)。

本研究所有HPV双重感染患者中，除16型外的另一HPV型别中，高危型主要为58型(15/78)、52型(13/78)和18型(9/78)，低危型主要为81型(5/78)、6型(4/78)和11型(2/78)。HPV16阳性CIN Ⅱ及以上病变患者主要为单一感染和双重感染，双重感染另一型别主要为58、33及18型，仅2例为低危型(HPV16+6、HPV16+44)。

表4 HPV16单一及多重感染在CIN Ⅱ及以上病变中的构成比

Tab.4 The prevalence of HPV16 infection in the patients with CIN Ⅱ and higher diseases in simple and multiple infections of HPV

GroupnCINⅡandhigherdiseasesnPrevalenceSimpleHPVsubtype23912753.14%TwoHPVsubtypes782633.33%Threeandmore HPVsubtypes351028.57%Total35216346.31%

3 讨论

HPV广泛存在于自然界中，无包膜，能特异感染人皮肤和黏膜上皮细胞，引起组织异常增生[4]。目前，经全基因测序证实HPV型别已超过200种[5]，根据致癌危险性将其分为低危型HPV和高危型HPV。低危型HPV主要引起生殖道湿疣、扁平湿疣及CIN Ⅰ，而高危型HPV感染主要引起CIN Ⅱ、CIN Ⅲ和宫颈癌[6]。2015年《美国宫颈癌筛查过渡期临床指南》中提到，对于>25岁女性，单一HPV检测可成为细胞学筛查以外的选择；且推荐30～65岁的女性每5年做一次细胞学与HPV联合筛查[7]。

HPV16是大部分地区检出率最高[8-10]的高危型HPV，其表达的3种癌蛋白E5、E6、E7对宫颈上皮细胞有刺激生长和转化的功能。E6、E7在癌细胞中持续表达，促使病毒DNA整合至宿主细胞染色体基因组的脆性位点处，分别干预P53和视网膜母细胞瘤(retinoblastoma，Rb)蛋白的表达，使其失去对细胞周期的正常调控，引起细胞无限增生并向恶性转化，从而发挥致癌作用。E5在癌症发生早期阶段通过干预细胞生长因子受体通路[11]、干扰细胞周期蛋白和细胞周期蛋白依赖激酶、促进病毒癌基因转化等过程而发挥致癌作用。E5还能下调miRNA 196a[12]，并通过与人白细胞抗原(human leukocyte antigen，HLA) Ⅰ类分子结合协助感染细胞免疫逃逸[13]，促进肿瘤发生。E5可与E6、E7协同发挥更强的致宫颈癌作用[14-15]。

在1 057例不同级别宫颈病变HPV阳性患者中，352例HPV16阳性，CIN Ⅲ中HPV16构成比最高，为73.08%，与宫颈炎、CIN Ⅰ、CIN Ⅱ、宫颈癌相比差异有统计学意义(χ2=125.59，P<0.05)。随着病程加重，HPV16的构成比有增加趋势(趋势性χ2=102.85，P<0.05)。该结果也证实HPV16持续性感染有更明确的致癌风险[16]。

本研究将患者按年龄分组，HPV16感染主要集中在30～50岁。在所有感染HPV16的患者中，>50岁组CIN Ⅱ及以上病变的患病率最高。随着年龄增加，CIN Ⅱ及以上病变的患病率有增加趋势。相关研究表明，免疫状况好、抵抗力强者机体可自行清除HPV感染。随着年龄增加，机体免疫力和抵抗力降低，无法自行清除HPV，临床及病理改变的概率增加，更有可能导致宫颈癌的发生[17]。

在HPV16阳性各级别宫颈病变患者中，均以单一HPV16感染为主，且随着病变级别增加，单一感染构成比增加。而在HPV16阳性宫颈癌患者中，84.38%为单一感染，无三重及以上多重感染，双重感染另一型别只有高危型HPV58和HPV45，无低危型，表明宫颈癌主要由高危型HPV感染所致。单一感染与多重感染患者中，CIN Ⅱ及以上病变的患病率差异有统计学意义，且随着感染型别种类增加，患病率有降低趋势，与相关文献有差异[18-19]。综上所述，本研究认为多重感染会增加上皮癌变的风险，但对高级别病变的发生未见明显促进作用。

目前研究表明，不同地区的HPV感染型别存在差异，但其主要感染型别及致病型别中均包含16型[20-22]。有研究表明，HPV16持续感染者在随后几年内罹患CIN Ⅲ的风险接近10%[23]。美国妇产科医师学会提出，HPV16阳性患者应行阴道镜检查。本研究也显示，宫颈高级别病变中HPV感染主要为HPV16感染，老年HPV16阳性者被检出CIN Ⅱ及以上病变的概率更大，多重感染并不影响疾病的发生发展，单一HPV16感染与疾病具有更大的相关性。本研究提醒人们应重视HPV16持续性感染，并按相关指南进行筛查与复查，及时发现与治疗，减少宫颈高级病变的发生。

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. LI Wanyi, E-mail：hxliwany@126.com

Correlation analysis between human papillomavirus 16 infection and cervical diseases in Chengdu

JIAN Jie1, LIANG Kairu2, YU Shaolan5, WANG Qingqing5, YI Xiaolian5, ZHAO Qingping4, SHI Yanyan3, XIE Chengbin3, XIA Chun4, GAO Lili4, LUO Na4, ZUO Fengqiong6, LI Wanyi1

1.DepartmentofMicrobiology,WestChinaofPreclinicalandForensicMedicine,SichuanUniversity,Chengdu610041,China; 2.DepartmentofWomen’sHealthCare,MaternalandChildHealthCareHospitalofSichuanProvince,Chengdu610031,China; 3.DepartmentofLaboratory,MaternalandChildHealthCareHospitalofSichuanProvince,Chengdu610031,China; 4.DepartmentofGynaecology,MaternalandChildHealthCareHospitalofSichuanProvince,Chengdu610031,China; 5.DepartmentofPathology,MaternalandChildHealthCareHospitalofSichuanProvince,Chengdu610031,China; 6.DepartmentofImmunology,WestChinaofPreclinicalandForensicMedicine,SichuanUniversity,Chengdu610041,China

The present paper aims to investigate the relationship between human papillomavirus 16 (HPV16) infection in cervical diseases, and to provide scientific basis for prevention and treatment of cervical cancer. The proportion of HPV16 in different cervical diseases, the prevalence of HPV16 infection in the patients with cervical intraepithelial neoplasia (CIN) Ⅱ and higher diseases in different age groups, and the prevalence of simple and multiple infections of HPV were analyzed. A total of 1 057 patients infected with HPV were selected, and subjected to sub-typing for HPVs. The results revealed that 352 patients were HPV16 positive and the proportion of HPV16 detection was the highest in CIN Ⅲ group. The proportion of HPV16 positive was significantly different among varied cervical diseases (P<0.05) and it gradually increased along with the increased disease grade (P<0.05). There were significant differences in the prevalence of HPV16 infection in the patients with CIN Ⅱ and higher diseases among different age groups (P<0.05). The prevalence increased with the increased age (P<0.05). The prevalence of HPV16 infection in the patients with CIN Ⅱ and higher diseases was significant different between HPV simple and multiple infections (P<0.05). With types of HPV increasing, the prevalence showed a tendency of increase. The research indicates that there is certain relationship between HPV16 infection and high-grade cervical lesions. The older persons infected with HPV16 have the greater risks for cervical cancer. Taking the persistent infection of HPV16 into account, timely diagnosis and treatment for HPV infection could reduce the occurrence of high-grade CIN and cervical cancer.

Human papillomavirus 16; Prevalence; Age; Multiple infection

四川省科技厅基金(2012JY0017)

李婉宜

2016-11-09)