QuEChERS结合柱净化的超高效液相色谱-串联质谱法测定有机肥中46种抗生素

汪建妹，刘艳平，陈 静，吴慧珍，夏 魏，李祖光，钱鸣蓉*

(1.浙江省农业科学院农产品质量标准研究所，浙江省植物有害生物防控重点实验室-省部共建国家重点实验室培育基地，浙江 杭州 310021；2.浙江工业大学 化工学院，浙江 杭州 310014；3.浙江医药股份有限公司，浙江 绍兴 312000)

QuEChERS结合柱净化的超高效液相色谱-串联质谱法测定有机肥中46种抗生素

汪建妹1，刘艳平2，陈 静3，吴慧珍2，夏 魏2，李祖光2，钱鸣蓉1*

(1.浙江省农业科学院农产品质量标准研究所，浙江省植物有害生物防控重点实验室-省部共建国家重点实验室培育基地，浙江 杭州 310021；2.浙江工业大学 化工学院，浙江 杭州 310014；3.浙江医药股份有限公司，浙江 绍兴 312000)

建立了超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)同时测定有机肥中磺胺类、喹诺酮类、大环内酯类46种抗生素的分析方法。样品用乙腈-EDTA缓冲溶液(pH 10.0)提取，盐析后离心分层，乙腈层按QuEChERS法，采用吸附剂净化；缓冲溶液层经HLB柱净化。ACQUITY UPLC BEH C18柱用作色谱分离，以2 mmol/L甲酸铵水溶液(含0.1%甲酸)-甲醇为流动相进行梯度洗脱；电喷雾电离源正离子(ESI+)多反应监测(MRM)模式检测，基质外标法定量。46种抗生素在1～200 μg/L范围内线性关系良好，相关系数(r2)为0.996 6～0.999 9。在25，100，400 μg/kg加标浓度下，3类抗生素的回收率分别为67.8%～95.6%，65.6%～89.4%和66.6%～107.8%，相对标准偏差为0.4%～11.9%；方法检出限(S/N=3)为0.6～4.6 μg/kg，定量下限(S/N=10)为2.1～15.4 μg/kg。

超高效液相色谱-串联质谱法(UPLC-MS/MS)；抗生素残留；有机肥；QuEChERS结合柱净化

大量研究表明，养殖场排出的动物粪便、污水和周边土壤中含有多种抗生素残留[1-6]，畜禽粪便经发酵加工后可作为有机肥施于农田，虽然部分抗生素在加工过程中发生吸附与降解，但商品有机肥中仍存在多种抗生素残留，对生态环境具有潜在危害[3-6]。因此，建立有效检测有机肥中抗生素的方法对于提高有机肥的质量和维护生态环境安全具有重要意义。

已报道的有机肥中抗生素检测方法主要通过机械振动或超声协助提取后，用HLB柱[4,7-9]或SAX-HLB串联柱净化[10-12]，然后以液相色谱-紫外法[4,10-11]或液相色谱-串联质谱法[7-9,12]测定。其中，Hu等[4]采用HLB单柱净化，高效液相色谱-紫外法测定有机肥中13种抗生素，需采用2种不同流动相分离待测物，导致部分抗生素的回收率低于60%；葛峰等[12]采用SAX-HLB串联柱进行富集与净化，超高效液相色谱-串联质谱法测定有机肥中18种抗生素，其过程相对繁琐、耗时较长。QuEChERS(Quick，easy，cheap，effective，rugged and safe)方法是集萃取和净化为一体的新型样品前处理方法，在食品检测中得到了广泛应用[13-14]，但在有机肥中抗生素多残留检测方面的应用未见报道。

本文针对目前畜禽业常用的磺胺类、喹诺酮类和大环内酯类46种抗生素，采用QuEChERS结合柱净化的前处理手段进行富集与净化，UPLC-MS/MS进行测定，建立了一种灵敏、高效同时测定商品有机肥中多种抗生素残留的分析方法。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

QTRAPTM6500三重四极杆-线性离子阱复合质谱系统(美国AB Sciex公司)；ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱(2.1 mm×50 mm，i.d.，1.7 μm，Waters公司)；Sorvall Primo R高速冷冻离心机(美国Thermo Fisher Scientific公司)；Oasis HLB固相萃取柱(200 mg，Waters公司，使用前分别以10 mL甲醇、10 mL去离子水活化)。甲醇、乙腈(色谱纯，美国Merck公司)；NaCl、无水Na2SO4、乙二胺四乙酸二钠(EDTA-Na2)(分析纯)；N-丙基乙二胺(PSA)、C18购自Agela公司。

18种磺胺类、19种喹诺酮类、9种大环内酯类药物购自Dr.Ehrenstorfer公司，纯度均高于97%。药物名称及缩写见表1。

1.2 标准溶液配制

以甲醇为溶剂分别配制标准储备液(20.0 mg/L)，于-18 ℃保存。临用时以甲醇稀释上述标准储备液，配制成所需浓度的标准工作液。

1.3 样品采集

样品为市售商品有机肥，于每种有机肥包装袋内5个不同位置采样，混匀后按照四分法取0.5 kg作为供试样品，风干粉碎后过1 mm筛，待用。

1.4 样品前处理

1.4.1 样品提取 称取1.0 g有机肥于50 mL离心管中，加入10 mL EDTA(pH 10.0)缓冲溶液，涡旋1 min，静置15 min后加入10 mL乙腈，涡旋1 min，7 000 r/min离心5 min，转移上清液于另一离心管中，加入4 g NaCl，涡旋15 s，再次离心5 min后分层，上层为乙腈层，下层为缓冲溶液层。

1.4.2 多级净化 取7 mL乙腈层于15 mL离心管中，加入350 mg PSA和700 mg C18，涡旋1 min，7 000 r/min离心5 min，取5 mL上清液于10 mL试管中，氮吹近干，待接收缓冲溶液层经固相萃取净化后的洗脱液。

取5 mL缓冲溶液层，用盐酸调节pH值至4.0，转移至活化后的HLB柱。待上样完毕后用10 mL水淋洗，7.5 mL 5%氨化甲醇洗脱，收集洗脱液于上述吹干的试管中，氮吹近干，以1 mL甲醇-水(50∶50)定容，混匀，过0.22 μm滤膜，上机检测。

1.5 UPLC-MS/MS条件

1.5.1 超高效液相色谱条件 色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱，柱温：40 ℃，进样体积：5.0 μL，流动相：A为2 mmol/L甲酸铵水溶液(含0.1%甲酸)，B为甲醇，流速：0.20 mL/min，梯度洗脱程序：0～3 min，5%～20% B；3～10 min，20%～30% B；10～16 min，30%～90% B，保持2 min；18～18.5 min，90%～10% B；18.5～19.5 min，10%～5% B，保持5.5 min。

1.5.2 质谱条件 离子源：电喷雾电离ESI(+)；喷雾电压：5 500 V；离子源温度：550 ℃；辅助气：40 psi；46种药物的多反应监测(MRM)参数见表1。

2 结果与讨论

2.1 前处理条件的优化

参考QuEChERs法(方法1)进行有机肥中抗生素的加标回收实验。1.0 g样品经10 mL EDTA缓冲溶液(pH 4.0)、10 mL乙腈超声提取15 min后，加入4 g NaCl，7 000 r/min离心5 min，取1 mL上清液，加入500 mg无水Na2SO4,50 mg PSA和100 mg C18净化并再次离心，取0.5 mL上清液，用去离子水定容至1 mL后过膜检测。基质外标法定量，结果如图1～3所示，磺胺类抗生素中，STZ和SML的回收率低于40%，另有8种磺胺类抗生素的回收率为40%～60%；大环内酯类中，CLI，TYL和KIT的回收率为41.5%～56.5%，LIN的回收率仅13.4%；喹诺酮类抗生素的提取效果普遍较差，仅有3种的回收率高于60%。随后改变缓冲溶液pH值(pH=7.0和10.0)，结果发现pH值的变化对乙腈相提取抗生素的效果影响较小。

图1 4种提取方法中18种磺胺类抗生素处于不同回收率范围内的数量Fig.1 Number of 18 sulfonamides located in different recovery ranges with four extraction methods

图2 4种提取方法中19种喹诺酮类抗生素处于不同回收率范围内的数量Fig.2 Number of 19 quinolones located in different recovery ranges with four extraction methods

图3 4种提取方法中9种大环内酯类抗生素处于不同回收率范围内的数量Fig.3 Number of 9 macrolides located in different recovery ranges with four extraction methods

由于部分抗生素易溶于水相，难以转移至乙腈相，故在方法2中对提取的上下两相分别进行净化。有机相采用吸附剂净化；水相经HLB柱净化，并以净化后的有机相作为洗脱液。收集洗脱液，氮吹近干，复溶过膜后检测。结果如图1～3，该改进步骤(方法2)可提高部分喹诺酮类抗生素的回收率，但仍有3种抗生素的回收率低于20%，9种抗生素的回收率为20%～40%，4种抗生素的回收率为40%～60%；大环内酯类中，TYL和KIT的回收率略低于40%；部分磺胺类的回收率略有降低，回收率在60%～100%范围内的抗生素数量降至4种，STZ，SPD，SMX，SML的回收率低于40%，故仍需优化。

在方法3中，有机相净化后直接转移至试管中氮吹近干，采用5%氨化甲醇作为HLB柱洗脱液[15-16]，并以上述含有机相的试管收集洗脱液，氮吹近干，复溶过膜后检测。结果表明，磺胺类抗生素中仅有3种的回收率低于60%(SDZ，STZ，SML)；9种大环内酯类的回收率均高于40%，且有5种的回收率为80%～110%；喹诺酮类抗生素的回收率普遍提高，较方法1和2均有明显改善。

pH值可能会影响缓冲溶液提取有机肥中抗生素的效率，因此在方法3的基础上，考察了3种pH值(pH=4.0，7.0，10.0)EDTA缓冲溶液对回收率的影响。当pH值为10.0时，磺胺类抗生素的回收率为68.4%～90.5%，喹诺酮类为65.8%～89.6%，大环内酯类为66.3%～107.8%，明显高于其他pH值缓冲溶液的提取效率(方法4)，结果见图1～3。高pH值的缓冲溶液能破坏药物在有机肥表面的氢键等吸附作用[17-18]，有利于化合物与基质的解离。因此本实验最终采用方法4作为样品前处理方法。

2.2 基质效应

将空白有机肥样品按“1.4”方法进行处理，分别配制50，100，200 μg/L 3个浓度水平的基质加标溶液和纯溶剂加标溶液，在优化前处理条件下，当平均基质效应(增强或抑制)超过20%，则认为基质效应对定量检测具有显著影响。基质效应(ME)通过下式计算:ME(%)=(A2-A1)/A1×100%。式中，A1为特定浓度下的抗生素在纯溶剂中的平均峰面积；A2为相同浓度下的抗生素在空白有机肥萃取液中的平均峰面积。采用改进的前处理方法处理有机肥样品并检测，结果显示6种抗生素(PIP，NOR，CIP，CIN，SPA，ERY)的基质增强或抑制效应略大于20%，因此采用基质匹配校正曲线定量，以减少基质干扰对结果的影响。

2.3 方法的线性关系

在优化的色谱-质谱条件下，46种抗生素混合标准溶液可获得较好地分离。选用空白有机肥样品按“1.4”方法处理，配制质量浓度分别为1.0，5.0，10.0，50，100，200 μg/L的基质标准溶液，以质量浓度(x,μg/L)为横坐标，定量离子色谱峰面积(y)为纵坐标绘制标准曲线。46种抗生素的基质匹配校正曲线在1.0～200 μg/L范围内线性关系良好，相关系数(r2)为0.996 6～0.999 9。图4为阳性猪粪源有机肥样品中4种检出抗生素的定量离子色谱图。

2.4 方法的回收率、精密度与检出限

选用空白有机肥样品，按所建立的方法处理，分别在25，100，400 μg/kg水平下进行加标回收实验，每个水平重复测定6次，磺胺类抗生素的平均回收率为67.8%～95.6%，相对标准偏差(RSD)为0.4%～7.6%；喹诺酮类的平均回收率为65.6%～89.4%，RSD为0.7%～10.9%；大环内酯类的平均回收率为66.6%～107.8%，RSD为1.5%～11.9%(表1)。在25 μg/kg加标回收实验条件下，根据3倍信噪比(S/N=3)确定46种抗生素的检出限(LOD)为0.6～4.6 μg/kg，S/N=10确定定量下限(LOQ)为2.1～15.4 μg/kg(见表1)。

表1 46种抗生素的保留时间、质谱参数、方法检出限、定量下限、回收率与相对标准偏差Table 1 Retention times,MS parameters,LODs,LOQs,recoveries and RSDs of 46 antibiotics

*quantitative ion

2.5 实际样品的分析

应用本方法测定了20份有机肥样品(10份猪粪源，10份鸡粪源)，对检出浓度超出线性范围的样品进行逐步稀释，结果检出SDZ，SM2，OFL，CIP，NOR，ENR和TIL，检出率分别为5%，30%，50%，15%，15%，65%和5%，检出含量分别为30.5 μg/kg，31.9～232.7 μg/kg，20.3～262.8 μg/kg，18.2～33.4 μg/kg，57～80.7 μg/kg，15.2～678.6 μg/kg和11 μg/kg。

3 结 论

本文建立了QuEChERS结合柱净化前处理手段，同时测定有机肥中46种抗生素的UPLC-MS/MS法，并成功应用于实际样品的分析。本方法操作简单、灵敏度强、回收率较高、稳定性好，能同时测定多种抗生素残留，可作为有机肥中兽药抗生素多残留痕量检测的方法。

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Determination of 46 Antibiotics Residues in Organic Fertilizer by UPLC-MS/MS with QuEChERS Combined with Column Purification

WANG Jian-mei1，LIU Yan-ping2，CHEN Jing3，WU Hui-zhen2，XIA Wei2，LI Zu-guang2,QIAN Ming-rong1*

(1.State Key Laboratory Breeding Base for Zhejiang Sustainable，Pest and Disease Control，Institute of Quality and Standard for Agro-products，Zhejiang Academy of Agricultural Sciences，Hangzhou 310021，China；2.College of Chemical Engineering，Zhejiang University of Technology，Hangzhou 310014，China；3.Zhejiang Medicine Co.，Ltd.，Shaoxing 312000,China)

A confirmative method was developed for the simultaneous determination of 46 antibiotics,including sulfonamides，quinolones and macrolides in organic fertilizer by ultrahigh performance liquid chromatography-tandem massspectrometry(UPLC-MS/MS).The samples were extracted with acetonitrile-EDTA buffer solution(pH 10.0),and separated by centrifugation after salting-out.The upper acetonitrile layer was purified by the QuEChERS steps with sorbents.The buffer solution layer was purified with solid-phase extraction cartridge.The separation of target drugs was performed on an ACQUITY UPLC BEH C18column using a mobile phase consisting of 2 mmol/L ammonium acetate with 0.1% formic acid and methanol by gradient elution．The analysis of target compounds was carried out with positive electrospray ionization(ESI+)source under multiple reaction monitoring(MRM) mode.The matrix-matched external standard calibration was used for quantification.Good linearities for the 46 antibiotics were achieved over the concentration of 1-200 μg/L,with correlation coefficients(r2) of 0.996 6-0.999 9.The recoveries of sulfonamides,quinolones and macrolides at spiked levels of 25，100,400 μg/kg were in the range of 67.8%-95.6%,65.6%-89.4% and 66.6%-107.8%,respectively,with relative standard deviations(RSDs) of 0.4%-11.9%.The limits of detection(LOD,S/N=3) were 0.6-4.6 μg/kg,and the limits of quantitation(LOQ,S/N=10) were 2.1-15.4 μg/kg.

ultrahigh performance liquid chromatography-tandem massspectrometry(UPLC-MS/MS)；antibiotics residues；organic fertilizer；QuEChERS combined with column purification

2016-08-04；

2016-10-24

农业部公益性行业专项(201303091)；浙江省自然科学基金(LY14B070008)；省部共建国家重点实验室培育基地项目(2010DS700124-ZZ1602);浙江省农业科学院中美三方合作项目(2010DS700124-ZM1604)；宁波科技项目(2013C11024)

10.3969/j.issn.1004-4957.2017.02.011

O657.63;O629.5

A

1004-4957(2017)02-0218-06

*通讯作者：钱鸣蓉，副研究员，研究方向：农产品质量安全，Tel：0571-86404015，E-mail：qian_mingrong123@163.com