分子印迹磁性固相萃取/液相色谱法检测奶制品中的双酚A

丘秀珍，黄志伟，朱惠娟，焦琳娟

(韶关学院 化学与环境工程学院，广东 韶关 512005)

研究简报

分子印迹磁性固相萃取/液相色谱法检测奶制品中的双酚A

丘秀珍*，黄志伟，朱惠娟，焦琳娟

(韶关学院 化学与环境工程学院，广东 韶关 512005)

以双酚A(BPA)为模板分子，磁性二氧化硅(Fe3O4@SiO2)为载体，4-乙烯基吡啶(4-VP)为功能单体，采用表面分子印迹技术制备了双酚A磁性分子印迹聚合物微球(Fe3O4@SiO2-MIPs)。通过红外光谱、透射电镜等对Fe3O4@SiO2-MIPs进行了结构和形貌的表征。将制得的Fe3O4@SiO2-MIPs作为磁性吸附剂，分离富集奶制品中的BPA，建立了分子印迹磁性固相萃取/液相色谱法测定奶制品中BPA的新方法。结果表明，在优化条件下，Fe3O4@SiO2-MIPs对BPA具有良好的选择性，最大吸附容量达13.50 mg/g，在0.05～5.0 mmol/L浓度范围内有良好的线性关系(r2=0.993 4)，方法检出限为0.037 μg/L，样品加标回收率为86.2%～93.1%，相对标准偏差为2.9%～3.8%。该方法高效快速，选择性好，可用于牛奶样品中痕量BPA的检测。

分子印迹聚合物；磁性固相萃取；双酚A；高效液相色谱法

双酚A(Bisphenol A，BPA) 是一种广泛用于生产聚碳酸酯(PC) 、环氧树脂(EP)、聚砜树脂、聚苯醚树脂等高分子材料的化工有机原料,在婴儿奶瓶、 微波炉饭盒及其他许多食品饮料的包装材料中均用到聚碳酸酯和环氧树脂。研究表明，双酚A具有雌激素的特性，故亦称“环境荷尔蒙”，含BPA的食品会诱发婴儿性早熟。这类物质在环境中难降解，易在生物体内蓄积，即使含量极低也能使生物内分泌失调，导致人体生殖器官异常、男性不育、乳腺癌发病率上升、雄性雌性化等病症出现。微量甚至痕量BPA即可对动物的生理状况、生殖系统以及胎儿发育造成不良影响[1]。目前，BPA 的分析方法主要有高效液相色谱法(HPLC)、气相色谱-质谱联用法(GC-MS) 及毛细管电泳法(CE) 等[2-4]。然而，实际样品中 BPA 的含量较低，且样品基底复杂导致干扰严重，很难直接检测。因此在分析前，对目标分析物进行选择性分离富集尤为重要。

分子印迹技术(Molecular imprinting technology，MIT)是指针对某一特定分子制备具有选择性识别能力的聚合物的技术。由于制备的分子印迹聚合物(Molecularly imprinted polymers，MIPs)具有预定性强、选择性高、重复利用性好等优点，已广泛应用于化学仿生传感器[5]、天然抗体模拟[6]和化学分离[7-9]等，特别适用于从生物样品、环境样品以及植物等复杂体系中分离特定目标分子。目前，分子印迹技术在BPA 检测中的应用已见报道[8]，如 Kong等[10]采用表面印迹技术克服了传统原位聚合法中印迹孔穴“深埋”的困难，提高了 MIPs 对目标物质的传质速率与吸附容量。但这些 MIPs 在洗脱模板和吸附过程仍需离心和过滤等繁琐操作。磁性固相萃取(MSPE)是一种以磁性材料作吸附剂基质的一种固相萃取技术,保留了传统固相萃取简单、高效和有机溶剂耗量少的优点。在磁性固相萃取过程中，磁性吸附剂不是填充到吸附柱中，而是直接被添加至样品的溶液或悬浮液中，将目标化合物吸附到分散的磁性吸附剂表面，在外部磁场作用下就可使目标化合物与样品基质分离[11]。近年来，有研究者将磁性固相萃取技术用于样品预处理并取得了很好的效果[12-17]。磁分离技术避免了普通固相萃取技术中操作繁琐、吸附柱易堵塞、重复性差等问题，同时具备富集效率高、分离过程简便等优点,因而具有很好的应用前景[10]。

本研究在磁性二氧化硅表面制备了分子印迹聚合物微球，并将其作为固相萃取的吸附剂进行样品前处理，建立了分子印迹磁性固相萃取/液相色谱检测奶制品中BPA的新方法。相较于其他BPA的检测方法，该方法分离快速、简便，回收率与灵敏度高，选择性好，可用于样品中痕量BPA的检测。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

LC-20A 高效液相色谱仪，配光电二极管阵列(PDA)检测器(日本岛津公司)；FTIR-Tracer 100傅里叶变换红外光谱仪(日本岛津公司)；DZF-6050D 真空干燥箱(上海齐欣科学仪器有限公司)；HT-7700透射电子显微镜(日本 Hitachi公司)；MPMS XL-7振动样品磁强计(美国Quantum公司)；EVOTGA-DSC/DT同步热分析仪(法国塞塔拉姆有限公司)。

双酚A、邻苯二酚、苯酚、4-肉桂苯酚(标准品，中国生物制品药品检验所)；三氯化铁、氯化亚铁、油酸、硅酸四乙酯(TEOS)、2,3-(环氧丙烷)丙基三甲氧基硅烷(KH 560)、4-乙烯基吡啶(4-VP)、乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA)、偶氮异丁腈(AIBN)均购于上海阿拉丁试剂有限公司；N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基亚砜(DMSO)、丙酮、氯仿、乙酸、氨水均为分析纯;乙腈、甲醇(色谱纯，天津艾杰尔科技有限公司)；实验用水为超纯水。

1.2 双酚A磁性分子印迹聚合物的制备

1.2.1 Fe3O4@SiO2磁性纳米颗粒的合成 Fe3O4@SiO2磁性纳米颗粒的合成参考文献[11]，操作步骤如下：称取3.975 g(0.02 mol)氯化亚铁和9.457 g(0.035 mol)氯化铁，分别溶于40 mL蒸馏水中。倒入500 mL三口瓶中，通氮气30 min，氮气氛围下油浴60 ℃。快速加入30 mL浓氨水，加热至80 ℃，反应1 h。滴加6 mL油酸，1 h后升温至90 ℃，熟化30 min，加1 mol/L盐酸。用水和乙醇分别洗涤沉淀5次，40 ℃真空干燥24 h，即得Fe3O4。称取一定量Fe3O4微球，溶于适量甲苯，配成浓度为20 mg/mL的油基磁流体。取100 mL磁流体加入250 mL三口瓶中，加入40 mL水、160 mL异丙醇和3 mL浓氨水，电动搅拌混合，通入氮气30 min。逐滴加入6 mL正硅酸四乙酯(TEOS)，室温下反应24 h。反应结束后用磁铁分离，分别用乙醇、水洗涤3次。60 ℃真空干燥24 h，即得Fe3O4@SiO2。

1.2.2 Fe3O4@SiO2硅烷化 称取1.0 g Fe3O4@SiO2，超声分散于20 mL DMF中，加入2 mL KH 560，在氮气氛围下90 ℃油浴反应12 h。反应结束后，产物依次用无水DMF、甲醇和丙酮洗涤，55 ℃真空干燥12 h。

1.2.3 Fe3O4@SiO2-MIPs磁性微球的合成 在100 mL的三颈烧瓶中加入1.0 mmol双酚A(模板分子)、4.0 mmol 4-乙烯基吡啶(功能单体)、1.0 g烷基化的Fe3O4@SiO2和15 mL 二甲亚砜(DMSO)，超声混合1 h。然后加入交联剂(EDGMA，20.0 mmol)和引发剂(AIBN，50 mg)，通氮除氧15 min后，氮气氛围下70 ℃油浴反应24 h。反应完成后，磁分离产物。用20%乙酸甲醇溶液索氏提取，得到除去BPA的灰色粉末。将所得产物真空干燥，即得磁性双酚A印迹聚合物(Fe3O4@SiO2-MIPs)，合成步骤见图1。磁性非印迹聚合物(Fe3O4@SiO2-NIPs)的制备与Fe3O4@SiO2-MIPs相同，只是不加模板分子BPA。

图1 双酚A分子印迹磁性微球的合成示意图Fig.1 Schematic of the preparation of BPA magnetic molecularly imprinted microsphere

1.3 MIPs磁性微球的吸附性能研究

准确量取10 mL 0.2 mmol/L双酚A溶液置于圆底烧瓶中，分别加入20.0 mg的Fe3O4@SiO2-MIPs和Fe3O4@SiO2-NIPs磁性微球。室温下转速为200 r/min振荡吸附120 min，每隔15 min磁性分离，取上层清液进HPLC测定溶液中剩余的双酚A浓度，按公式(1)计算吸附容量：

(1)

式中c0(mmol/L)和ce(mmol/L)分别为标准溶液的初始浓度和平衡吸附浓度，M为摩尔质量，V(mL)和W(g)分别是吸附溶液的体积和MIPs的质量。吸附后的Fe3O4@SiO2-MIPs加入10 mL 20%的乙酸甲醇溶液去除模板分子双酚A，再用纯甲醇洗涤数次干燥后重新使用。相同方法研究Fe3O4@SiO2-MIPs的静态吸附性能、选择性和重复利用性能等。

1.4 样品前处理方法

取2 mL纯牛奶，加入5 mL乙腈，振荡混合1 min，以4 000 r/min转速离心20 min，取上层清液，准确加入20.0 mg Fe3O4@SiO2-MIPs磁性微球，室温下振荡萃取30 min后，用磁铁磁性分离，取上清液供HPLC测定。

1.5 色谱条件

Dikma Diamonsil C18色谱柱(250 mm×4.6 mm)，流动相：乙腈-水(50∶50)，流速：1.0 mL/min，检测波长：279 nm。

图2 Fe3O4@SiO2(a),Fe3O4@SiO2-KH 560(b)和Fe3O4@SiO2-MIPs(c)的红外光谱Fig.2 FT-IR spectra of Fe3O4@SiO2(a),Fe3O4@SiO2-KH 560(b) and Fe3O4@SiO2-MIPs(c)

图3 Fe3O4@SiO2-MIPs(a)和Fe3O4(b)的热重分析曲线Fig.3 TGA curves of Fe3O4@SiO2-MIPs(a) and Fe3O4(b)

2 结果与讨论

2.1 MIPs磁性微球的表征

2.1.2 热重分析 图3为Fe3O4和Fe3O4@SiO2-MIPs的TGA曲线，其中曲线a显示Fe3O4@SiO2-MIPs在205 ℃和 344 ℃之间有一快速失重的阶段，这是源于Fe3O4@SiO2的表面分子印迹聚合物。该结果说明Fe3O4@SiO2表面已成功聚合了MIPs涂层。

2.1.3 TEM表征 采用TEM表征Fe3O4@SiO2-MIPs微球的形貌特征，由图4A可以看出，通过共沉淀法合成的Fe3O4@SiO2纳米颗粒展现出均一的球形，颗粒大小约为100 nm。图4B显示经过硅胶表面修饰后接枝MIPs层后，Fe3O4@SiO2外层包覆了MIPs涂层。根据TEM图像计算，MIPs涂层的平均厚度约为20 nm，而薄的MIPs层更有利于传质和结合。

2.2 Fe3O4@SiO2-MIPs磁性微球的吸附性能分析

图5 Fe3O4@SiO2-MIPs 和 Fe3O4@SiO2-NIPs的吸附动力学曲线Fig.5 Adsorption kinetic curves of Fe3O4@SiO2-MIPs and Fe3O4@SiO2-NIPs for BPA

2.2.1 Fe3O4@SiO2-MIPs的动态吸附实验 比较了Fe3O4@SiO2-MIPs和Fe3O4@SiO2-NIPs的动力学吸附曲线(图5)。在0～45 min 范围内，Fe3O4@SiO2-MIPs的吸附容量随时间的变化增长较快，45 min后吸附容量变化缓慢，基本达到吸附平衡；而Fe3O4@SiO2-NIPs的吸附容量随时间的变化增长较慢，吸附容量较小。故选定45 min为后续磁性固相萃取的最佳吸附时间。

图6 Fe3O4@SiO2-MIPs和Fe3O4@SiO2-NIPs的平衡吸附曲线Fig.6 Adsorption isotherms of Fe3O4@SiO2-MIPs and Fe3O4@SiO2-NIPs for BPA

2.2.2 Fe3O4@SiO2-MIPs的平衡吸附实验 图6为Fe3O4@SiO2-NIPs和Fe3O4@SiO2-MIPs 对BPA的吸附等温线。通过Langmuir方程拟合实验数据，Fe3O4@SiO2-MIPs和Fe3O4@SiO2-NIPs对BPA的饱和容量分别为13.5 mg/g和1.6 mg/g。Fe3O4@SiO2-MIPs的吸附容量远高于Fe3O4@SiO2-NIPs，前者的吸附量约为后者的8.5倍。表明Fe3O4@SiO2-MIPs微球表面比Fe3O4@SiO2-NIPs具有较多的BPA分子印迹空穴，对BPA具有更优异的选择性识别能力。

2.2.3 Fe3O4@SiO2-MIPs磁性微球的选择性 为了考察Fe3O4@SiO2-MIPs对BPA的选择性能，本文选取4-肉桂苯酚、苯酚、邻苯二酚3种结构类似物作竞争底物。配制0.2 mmol/L的BPA及其结构类似物的混合溶液，加入50.0 mg的Fe3O4@SiO2-MIPs，置于恒温摇床中，室温下转速为200 r/min振荡吸附90 min。然后磁性分离，取上清液用HPLC测定各物质的剩余浓度，按公式(1)计算吸附容量。

图7 BPA及其类似物的吸附性能Fig.7 Adsorption performances of BPA and its analogues

图8 加标样品经Fe3O4@SiO2-MIPs吸附前后的色谱图Fig.8 Chromatograms of BPA obtained from milk sample before and after Fe3O4@SiO2-MIPs extraction a.4-cumylphenol(4-叔丁基苯酚)；b.phenol(苯酚)；c.catechol(邻苯二酚)

结果显示，Fe3O4@SiO2-MIPs对BPA的吸附容量明显高于4-肉桂苯酚、苯酚和邻苯二酚3种结构类似物，且4-肉桂苯酚与BPA的结构相似度大于苯酚、邻苯二酚，吸附容量也高于其他两种类似物(图7)，这说明Fe3O4@SiO2-MIP对BPA的高选择性主要源于其MIPs空穴。Fe3O4@SiO2-NIPs对BPA及其3种类似物的吸附量相近，说明Fe3O4@SiO2-NIPs对BPA无选择性。

2.2.4 Fe3O4@SiO2-MIPs的吸附重现性 为了考察Fe3O4@SiO2-MIPs的重复利用率，本文采用Fe3O4@SiO2-MIPs对0.2 mmol/L的BPA溶液进行6次吸附-解吸附循环试验。结果显示，经过6次循环吸附试验，Fe3O4@SiO2-MIPs的吸附效率只降低5.3%，说明其具有良好的重复利用性能。

2.3 牛奶中BPA的磁性分离与分析

为了考察Fe3O4@SiO2-MIPs在实际样品中的应用分析能力，本文采用Fe3O4@SiO2-MIPs对一系列不同浓度的加标牛奶样品进行测试。将20 mg Fe3O4@SiO2-MIPs作为分子印迹磁固相萃取吸附剂对实际样品中的BPA进行分离富集，然后用HPLC/PDA对BPA进行检测。结果表明，在0.05～5.0 mmol/L浓度范围内，BPA具有良好的线性关系，相关系数(r2)为0.993 4。加标牛奶样品经Fe3O4@SiO2-MIPs吸附处理后的色谱图，杂质峰明显减少(图8)。该方法对BPA的检出限(S/N<3)为0.037 μg/L，低于大部分已报道的BPA检测方法。通过对高、中、低3个不同浓度的加标牛奶样品进行回收率测定，测得BPA在1.0，10.0,100.0 μmol/L加标水平下的加标回收率分别为86.2%，93.1%，91.2%，相对标准偏差分别为3.2%，3.8%，2.9%。说明该方法可用于牛奶样品中痕量BPA的检测。

3 结 论

本文建立了一种新的磁性分子印迹聚合物应用于BPA的选择性分离检测的方法。利用分子印迹技术在磁性纳米粒子的表面修饰上一层薄而均匀的分子印迹涂层，所合成的Fe3O4@SiO2-MIPs对BPA具有很高的吸附量，专一性的识别能力，并且具有良好的重现性。该方法已成功应用于牛奶样品中BPA含量的分析检测。

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Determination of Bisphenol A in Milk Sample Using Magnetic Molecularly Imprinted Polymers Solid-phase Extraction Combined with High Performance Liquid Chromatography

QIU Xiu-zhen*,HUANG Zhi-wei,ZHU Hui-juan,JIAO Lin-juan

(College of Chemistry and Environmental Engineering,Shaoguan University,Shaoguan 512005,China)

A new magnetic molecularly imprinted polymers(MIPs) were prepared by using Fe3O4@SiO2as the support,4-vinyl pyridine(4-VP) as functional monomer,bisphenol A(BPA) as template molecule through surface molecularly imprinted polymerization technology.The structure and morphology of Fe3O4@SiO2-MIPs were characterized by infrared spectroscopy(IR)and transmission electron microscopy(TEM).A new method was established for the separation and enrichment of BPA in milk sample by molecularly imprinted magnetic solid-phase extraction combined with high performance liquid chromatography(HPLC) using Fe3O4@SiO2-MIPs as magnetic adsorbent.The results showed that the Fe3O4@SiO2-MIPs has a high selectivity for BPA under the optimized experimental condition,and the adsorption capacity of Fe3O4@SiO2-MIPs was 13.50 mg/g.The calibration curve of BPA was linear in the range of 0.05-5.0 mmol/L with a correlation coefficient(r2) of 0.993 4.The limit of detection(LOD) was as low as 0.037 μg/L.The proposed method was successfully applied in the determination of BPA in milk sample,with average recoveries of 86.2%-93.1%and relative standard deviations(RSDs) of 2.9%-3.8%at three spiked levels.The developed method is rapid and selective,and is adaptable to the analysis of trace BPA in milk sample.

molecular imprinted polymers;magnetic solid-phase extraction;bisphenol A;high performance liquid chromatography(HPLC)

2016-08-20；

2016-09-21

广东省自然科学基金项目(2014A030307024)；2015年广东省大学生创新创业立项项目(201510576042)；2016年广东大学生科技创新培育专项资金(pdjh2016b0458)

10.3969/j.issn.1004-4957.2017.02.014

O657.72;O625.31

A

1004-4957(2017)02-0236-06

*通讯作者：丘秀珍，硕士，副教授，研究方向：复杂体系分离分析，Tel：0751-8120118，E-mail:Gold0226@126.com