HPLC测定食品包装用胶黏剂中5种树脂酸含量

王 乐，郑新华，项海波，陈 晞 ，张爱霞

(1.济南出入境检验检疫局，山东 济南 250014;2.山东出入境检验检疫局,山东 青岛 266000)

HPLC测定食品包装用胶黏剂中5种树脂酸含量

王 乐1*，郑新华1，项海波2，陈 晞1，张爱霞1

(1.济南出入境检验检疫局，山东 济南 250014;2.山东出入境检验检疫局,山东 青岛 266000)

建立高效液相色谱测定食品包装用胶黏剂中枞酸、新枞酸、去氢枞酸、长叶松酸和左旋海松酸的分析方法。对样品前处理和色谱分析条件进行了优化，以乙酸乙酯为溶剂，甲醇沉淀高聚物离心后微孔滤膜过滤，乙腈-0.4%乙酸水(80∶20)为流动相，流速为1.0 mL/min，等度洗脱，采用Venusil MP C18(2)色谱柱，二极管阵列检测器(DAD)，高效液相色谱法测定，枞酸和新枞酸的检测波长为240 nm，长叶松酸和左旋海松酸为270 nm，去氢枞酸为208 nm，以外标法定量。结果表明，5种树脂酸的定量下限为2.5～10.0 mg/kg，线性范围跨越两个数量级以上，连续6次进样的相对标准偏差(RSD)不大于3.4%，加标回收率为92.2%～103.6%。该方法操作简单、干扰因素少、分析速度快，满足食品包装用胶黏剂中5种树脂酸的检测要求。

食品包装；胶黏剂；树脂酸；高效液相色谱

松香黏性甚佳，尤其是压敏性、快黏性、低温黏性很好，因此作为胶黏剂的重要组成部分应用于制造工业，特别是以塑料、纸张为基材的食品包装[1-2]，如食品标签、复合食品包装材料等。因基材本身具有一定的渗透性能，作为助剂使用的胶黏剂中的有毒有害成分在食品包装的储存及使用过程中存在向食品迁移的风险，继而引起食品安全问题[3-4]。松香的主要成分为枞酸、新枞酸、去氢枞酸、长叶松酸和左旋海松酸等同分异构的树脂酸[5]，毒理学研究表明枞酸等树脂酸可导致人体肺泡上皮细胞溶解，对人体红细胞、多核白细胞有毒性作用[6-8]，可损伤DNA的活性[9]，另有报道称，银屑敌胶囊中因含非法添加物松香酸，造成部分患者失明、急性肝坏死等[10]。据此，欧盟分类法规已将松香含量大于1%的产品标识为R43(能引起皮肤过敏)[11]。

树脂酸的测定大多采用气相色谱法[12]、气相色谱-质谱联用法[13-14]、高效液相色谱法[15-16]、液相色谱-质谱联用法[17-18]，检测对象有化妆品、药材、食品、松香产品等，其中气相色谱法可检测多种树脂酸的同分异构体，但需甲酯化，操作较复杂且无法有效区分树脂酸和树脂酸甲酯；液相色谱法可检测的目标物仅局限于枞酸和脱氢枞酸，无法有效区分多种枞酸同分异构体，因此不能对枞酸异构体总量进行准确定量。目前，有关食品包装用胶黏剂中多种同分异构树脂酸的液相色谱检测方法尚未见报道。本文以枞酸、新枞酸、去氢枞酸、长叶松酸和左旋海松酸5种树脂酸作为食品包装用胶黏剂中松香的主要标志物，研究确定了样品的提取方法，首次建立了枞酸、新枞酸、去氢枞酸、长叶松酸和左旋海松酸5种树脂酸的HPLC分离、测定条件。本方法操作便捷、准确，研究结果可为完善我国胶黏剂标准以及食品包装企业正确选择胶黏剂提供借鉴。

1 实验部分

1.1 仪器、试剂与材料

Agilent1260 液相色谱仪(美国安捷伦公司)，配有二极管阵列(DAD)检测器；色谱柱：AgelaVenusil MP C18(2)(4.6 mm×250 mm×5 μm，天津博纳艾杰尔)。KQ700DE超声波发生器(昆山市超声仪器有限公司。枞酸标准品(75.0%，美国Toronto Research Chemicals Inc.)，新枞酸标准品(98.0%，美国Sigm公司)，脱氢枞酸标准品(96.0%，美国Toronto Research Chemicals Inc)，长叶松酸标准品(99.5%，挪威Chiron公司)，左旋海松酸标准品(96.5%，挪威Chiron公司)；乙酸乙酯、乙腈、甲醇、乙酸(HPLC级，美国Fisher公司)。标准溶液：用甲醇配制1 000 mg/L的树脂酸标准储备溶液，使用时再以甲醇逐级稀释。

阳性样品的制备：分别称取10 g不含树脂酸的309胶(自然干燥至恒重)、热熔胶空白样品于两烧杯中，各加入20 mL乙酸乙酯使之完全溶解，再分别加入0.01 g，0.1 g(精确至0.000 1 g)枞酸标准品，搅拌或超声混匀后，将液体倒入玻璃培养皿中，放入通风橱内，待乙酸乙酯全部挥发后，得到枞酸含量分别为1 000，10 000 mg/kg的两种阳性样品。

1.2 色谱条件

流动相：乙腈-0.4%乙酸水(80∶20)，等度洗脱；流速：1.0 mL/min；柱温：室温；检测波长：208 nm，240 nm和270 nm；进样体积：10 μL。

1.3 样品制备

称取2.5 g(精确至0.001 g)样品于50 mL具塞玻璃离心管中，准确加入5 mL 乙酸乙酯完全溶解后，加入20 mL甲醇涡流、沉淀，静置5 min后过0.22 μm 滤膜，上机测定。

2 结果与讨论

2.1 前处理方式的选择

胶黏剂中有毒有害物质的提取通常以甲醇为提取溶剂，采用超声[19]、振荡[20]等方法时，对于致密样品中的目标物可能提取不完全，会导致检测结果偏低。国标GB19340-2014采用乙酸乙酯完全溶解胶黏剂样品[21]，考虑到胶黏剂的高分子聚合物基体进入液相时会对色谱系统造成污染，本研究采用甲醇为沉淀剂将基质杂质等聚合物除去[22]。实验采用制备的两种胶黏剂阳性样品，对比了甲醇超声法提取(甲醇为提取溶剂，25 mL超声提取60 min)和乙酸乙酯溶解/甲醇沉淀法(溶解/沉淀法)对309胶和热熔胶的提取效率。结果显示，乙酸乙酯溶解/甲醇沉淀法的提取效率(回收率均大于90%)明显好于甲醇超声法(回收率低于30%)，且未有枞酸以外的树脂酸种类检出，这是由于乙酸乙酯为有机强溶剂，可在不改变样品pH值的情况下完全溶解或分散各种类型的胶黏剂样品以提取目标物，且不改变各树脂酸同分异构体的平衡状态，从而可以得到各树脂酸同分异构体的准确含量。而甲醇由于对于致密或粘稠的胶黏剂的溶解性较差，提取效率不高。因此，本研究选取乙酸乙酯溶解/甲醇沉淀法进行样品前处理。

图1 不同色谱柱分析5种树脂酸的液相色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of 5 resin acid standards under different chromatographic column

图2 乙腈-水(80∶20)体系中5种树脂酸的液相色谱图Fig.2 HPLC chromatograms of 5 resin acid standards under acetonitrile-water(80∶20)

图3 不同检测波长下5种树脂酸的液相色谱图Fig.3 HPLC chromatograms of 5 resin acid standards under different detection wavelengths

2.2 液相色谱条件的优化

2.2.1 色谱柱的选择 本研究的目标物包含枞酸、新枞酸、去氢枞酸、长叶松酸和左旋海松酸，其中枞酸、新枞酸、长叶松酸和左旋海松酸为同分异构体，它们的分离为液相色谱柱的选择带来了挑战。C18柱是液相色谱最常用的反相色谱柱，由于键合基质、载碳量、硅羟基封尾基团的不同，C18色谱柱的选择性和分离效果会有很大的差别。本研究尝试了多种型号的C18色谱柱，实验结果见图1。采用Thermoaccucore C18，Waters XTerra@ RP18，AgelaVenusil XBP C18(L)进行实验时，4种同分异构体的出峰时间相同或相近，分离效果均不理想。实验发现AgelaVenusil MP C18(2)和AgilentTC-C18(2)色谱柱对5种目标物均具有较好的分离效果，但由于AgilentTC-C18(2)对于左旋海松酸、长叶松酸与枞酸的分离差于AgelaVenusil MP C18(2)。因此，最终选择AgelaVenusil MP C18(2)进行分析。

2.2.2 流动相的选择 采用AgelaVenusil MP C18(2)色谱柱进行分离，分别对甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.4%乙酸水等流动相体系进行考察。结果显示，甲醇-水体系在40 min仍不出峰。采用乙腈-水体系时4种同分异构体只分成两组峰且峰形较差(图2)。而乙腈-0.4%乙酸水体系有利于树脂酸同分异构体的分离且色谱峰对称性较好。进一步对乙腈和乙酸水的比例进行优化，当乙腈与0.4%乙酸水的体积比为 80∶20，流速1.0 mL/min时，5种目标化合物可在20 min 内依次出峰(图3)。

2.2.3 检测波长的选择 在190～450 nm范围内测定5种树脂酸标准溶液的紫外-可见吸收光谱，枞酸、新枞酸、长叶松酸、左旋海松酸和去氢枞酸的最大吸收波长分别为240，250，266，275，200 nm。为降低邻近峰的干扰，本研究选择多通道监测，枞酸和新枞酸采用240 nm 波长进行定量计算，长叶松酸和左旋海松酸采用270 nm 波长进行定量计算；为降低乙腈、甲醇试剂在低波长的干扰，去氢枞酸采用208 nm 波长进行定量计算。

2.3 线性范围与定量下限

取各树脂酸标准储备液，用甲醇逐级稀释配成适宜范围的混合标准工作溶液。在优化条件下进行测定，以各目标物的质量浓度(x，mg/L)为横坐标，色谱峰的峰面积(y)为纵坐标进行拟合，计算各化合物的线性方程、相关系数(r)和线性范围。以空白胶黏剂样品加标，按本文建立的方法进行处理和测定，以信噪比(S/N)大于10计算得到方法的定量下限(LOQ)。结果显示，新枞酸和长叶松酸在0.25～100.0 mg/L、左旋海松酸和枞酸在0.35～100.0 mg/L、去氢枞酸在1.0～100.0 mg/L范围内呈良好的线性关系(r≥0.999 9)，5种树脂酸的定量下限为2.5～10.0 mg/kg。

表1 5种树脂酸的线性方程、相关系数及定量下限Table 1 Regression equations,correlation coefficients(r) and limits of quantitation(LOQ) of 5 resin acids

2.4 回收率与精密度

在选定的前处理和测定条件下，以空白胶黏剂样品(环保透明型万能胶)加标使基质中去氢枞酸的最终含量分别为10.0，20.0，100.0 mg/kg，其余各树脂酸的最终含量分别为4.0，8.0，40.0 mg/kg，每个水平连续平行测定6次，加标回收率和相对标准偏差(RSD)结果见表2。由表2可见，方法的加标回收率为92.2%～103.6%，RSD为0.43%～3.4%，表明本方法的回收率高、精密度好。

表2 胶黏剂中5种树脂酸的加标回收率和精密度Table 2 Recoveries and precisions(RSD) of 5 resin acids in adhesives

2.5 实际样品分析

用本文建立的方法对市售16份胶黏剂样品(其中309万能胶2份、502强力胶1份、302强力胶1份、环保透明型万能胶4份、PVC-U胶黏剂2份、双面胶5份、热熔胶1份)进行枞酸、新枞酸、去氢枞酸、长叶松酸和左旋海松酸的测定，结果见表3。其中，309万能胶、502强力胶、302强力胶、环保透明型万能胶、PVC-U胶黏剂为溶剂型胶黏剂，易溶解或分散于乙酸乙酯；双面胶、热熔胶样品较粘稠或致密，需要超声辅助分散或溶解。从检测结果看，2份309万能胶和4份双面胶样品检出枞酸、新枞酸、去氢枞酸和长叶松酸，未检出左旋海松酸；1份302强力胶仅检出去氢枞酸；1份双面胶样品和1份热熔胶样品中5种树脂酸均有检出；其余样品为阴性样品。

表3 阳性胶黏剂样品中5种树脂酸的含量Table 3 Contents of 5 resin acids in positive adhesive samples (mg·kg-1)

n.d.:no detected

3 结 论

本文建立了HPLC测定食品包装用胶黏剂中5种树脂酸含量的方法。研究确定了优化的样品前处理和色谱分析条件，实现了食品包装用胶黏剂中枞酸、新枞酸、长叶松酸和左旋海松酸4种同分异构体树脂酸与去氢枞酸的同时快速测定。各树脂酸在一定浓度范围内呈良好的线性关系(r≥0.999 9)，加标回收率为92.2%～103.6%，相对标准偏差不高于3.4%，定量下限为2.5～10.0 mg/kg。该方法前处理简单、灵敏度高、重复性好、稳定性高，可用于食品包装用胶黏剂中5种树脂酸含量的测定。

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Determination of 5 Resin Acids in Food Contact Adhesives by HPLC

WANG Le1*,ZHENG Xin-hua1,XIANG Hai-bo2,CHEN Xi1,ZHANG Ai-xia1

(1.Jinan Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau,Jinan 250014,China;2.Shandong Entry and Exit Inspection and Quarantine Bureau,Qingdao 266000,China)

A high performance liquid chromatographic(HPLC) method was developed for the determination of 5 resin acids,including abietic acid,neoabietic acid,dehydroabietic acid,palustric acid and levopimaric acid in food contact adhesives．The conditions of sample pretreatment and chromatographic separation were optimized.The sample was dissolved with ethyl acetate,and the polymer was precipitated with methanol.After filtration with filter membrane,the extract was separated on a Venusil MP C18(2) column with acetonitrile-0.4%acetic acid(80∶20) as mobile phase at a flow rate of 1.0 mL/min,detected accurately by HPLC with diode-array detector(DAD) at 240 nm for abietic acid and neoabietic acid,270 nm for palustricacid and levopimaric acid,208 nm for dehydroabietic acid,and quantified by the external standard method．The HPLC method showed a good linearity above two orders of magnitude，with detection limits of 2.5-10.0 mg/kg.The RSDs for 5 resin acids were no more than 3.4%,and the recoveries were in the range of 92.2%-103.6%．The method has the advantages of simple operation,rapid analysis and less interference factors,and could provide credible analysis for 5 resin acidsin food contact adhesives.

food package;adhesive;resin acids;high performance liquid chromatography(HPLC)

2016-08-23；

2016-09-21

质检总局科研项目(2015IK212)；国家认监委科研制标项目(2015B074)

10.3969/j.issn.1004-4957.2017.02.020

O657.72；O622.5

A

1004-4957(2017)02-0267-05

*通讯作者：王 乐，博士，高级工程师，研究方向：食品及食品接触制品品质研究与分析，Tel：0531-88527039，E-mail：dingshenyong@163.co