细胞转分化在神经系统疾病治疗中的研究进展

裴春丽，王树坤，张春立

（1.中国科学院生物物理研究所脑与认知科学国家重点实验室，北京 100101；2.军事医学研究院军事认知与脑科学研究所，北京 100850；3.美国得州大学西南医学中心分子生物学系，美国得克萨斯州 75390）

常见的神经系统疾病包括神经退行性疾病、创伤性神经系统损伤以及神经精神障碍疾病等，由于神经细胞功能异常或缺失而造成一系列例如运动、语言、社交、感知觉障碍等临床表现，严重影响患者健康和生活质量，给家庭和社会带来沉重负担。从传统意义上来说，神经元缺失造成的神经系统疾病的发生发展是不可逆的，目前临床救治主要以药物和手术控制疾病进程为主，始终无法达到令人满意的治愈效果。因此，尽快建立一套合理有效的治疗机制显得尤为重要。通过细胞治疗获得神经细胞以替代受损的神经元为神经系统疾病的治疗提供了新策略。

早期细胞治疗手段有自体或异体干细胞移植［1］。自体干细胞主要是神经干细胞移植，其优点是不存在免疫排斥和伦理问题，但由于其取材困难或有限，且移植后分化为功能性神经元的效率较低等原因，难以达到理想的治疗效果。异体干细胞主要是胚胎干细胞移植。作为全能性干细胞，胚胎干细胞的多向分化潜能特性在细胞移植中却是把双刃剑，一方面使其可用于多种疾病的治疗，另一方面由于其分化的不确定性往往存在致瘤风险，而且异体干细胞移植存在伦理道德和免疫排斥等问题。因此，急需寻求来源广泛且安全有效的细胞来源以用于临床治疗。

体细胞重编程技术的兴起和发展为细胞治疗带来新的曙光。体细胞重编程治疗神经系统疾病主要有2种策略：①将体细胞重编程为诱导型多能干细胞（induced pluripotent stem cells，iPSC）直接用于细胞治疗［2］，或将iPSC进一步分化为神经干细胞或神经元用于细胞治疗。2006年，Yamanaka实验室利用八聚体结合转录因子3/4（octamer-binding transcription factor 3 or 4，Oct3/4）、性别决定Y 区域转录因子 2（sex determining region Y-box 2，Sox2）、Kruppel样因子 4（Kruppel-like factor 4，Klf4）和骨髓细胞瘤基因（cellular myelocytomatosis，c-MyC）4个转录因子将小鼠成纤维细胞成功重编程为iPSC［3］。2007年，该实验室又将人成纤维细胞重编程为人iPSC（human iPSC，hiPSC）［4］。iPSC 的获得无疑是重编程领域中里程碑式的研究。该方法取材简单，避免了免疫和伦理问题，并且理论上能获得足够数量的细胞用于治疗。但由于iPSC为多能干细胞，其所存在的致瘤隐患仍不容忽视。②将体细胞不经过多能干细胞，直接转分化为神经干细胞、神经前体细胞或神经元等［5］。这种由一种已分化细胞不经多能干细胞阶段直接转化为另一种类型细胞状态的重编程过程即为转分化［6］。转分化研究最早追溯到1987年，Davis等［7］通过在小鼠成纤维细胞中过表达成肌分化抗原（myogenic differentiation antigen，MyoD）使其转分化为成肌细胞，首次通过过表达转录因子实现细胞类型的转换，是继细胞核移植和细胞融合等技术之后，在重编程领域又一里程碑式的探索。此后，有关细胞类型之间转换的文章陆续被报道，研究者们不仅实现了同一胚层不同类型细胞之间的转分化，还进一步实现了跨胚层间的转分化。2000年，Shen等［8］发现在胰腺外分泌细胞中过表达CCAAT/增强子结合蛋白β（CCAAT/enhancer binding protein beta，C/EBPβ）可将其转分化为肝细胞；2002年，Heins等［9］在胶质原纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）阳性的胶质细胞中过表达配对盒蛋白6（paired box protein-6，Pax6）使其转分化为神经细胞；2004年，有文章报道，过表达C/EBPα和C/EBPβ可实现B细胞向巨噬细胞的转分化［10］。转分化具有细胞来源广泛、转化周期短，转化效率高等优点，更重要的是避免了致瘤性的发生。目前，通过转分化技术已成功获得了谷氨酸能神经元、γ-氨基丁酸（γ-amino butyric acid，GABA）能神经元、多巴胺能神经元、脊髓运动神经元和5-羟色胺神经元等多种亚型神经元［11］，为实现转分化技术在神经系统疾病的临床应用奠定了良好的基础（图1）。随着基础研究的深入开展，转分化作为细胞重编程领域的一个分支在临床应用方面相比胚胎干细胞以及iPSC具有更多的优势，本文着重综述转分化在神经系统疾病中的应用。

图1 转分化在神经系统疾病中的研究进展.转分化在神经退行性疾病、创伤性中枢神经损伤、神经精神障碍疾病中的研究.成纤维细胞或星形胶质细胞在不同基因作用下诱导转化为不同神经元亚型.PD，帕金森病；AD，阿尔茨海默病；HD，亨廷顿舞蹈病；ALS，肌萎缩侧索硬化病；TBI，创伤性脑损伤；SCI，脊髓损伤；Ascl1：Achaete-scute复合体同源基因1蛋白；Brn2：POU家族蛋白转录因子2；Myt1l：髓鞘转录因子1；Lmx1a：LIM同源框转录因子1a；Foxa2：叉头框蛋白a2；NeuroD1：神经分化因子1；Bcl11b：B细胞白血病/淋巴瘤11b；Dlx：同源盒转录因子；Neurog2神经生长因子2；Lhx3：LIM同源框蛋白质3；Isl1：LIM同源域蛋白家族转录因子1；Hb9：同源盒基因；Sox2：性别决定Y区域转录因子2；VPA：丙戊酸；FEV：第五Ewing变体蛋白；Lmx1b：LIM同源框转录因子1b.

1 转分化研究在神经系统疾病中的常用方法

转分化是极其复杂的细胞重编程过程，细胞由一种分化状态转变成另一种分化状态，其转录表达谱、表观遗传修饰和染色质结构等都发生改变［12］。研究者可通过多种方式实现体外或体内转分化，常用方法包括：①转录因子诱导：将携带转录因子的病毒载体转入细胞诱导其转分化，这是最常用的转分化诱导方式，例如病毒载体携带的转录因子Pax6可将胶质细胞转分化为神经元［9］。常用的病毒载体有逆转录病毒和慢病毒，但它们需整合入基因组，存在插入突变、残基表达等问题，可能增加致瘤风险。而非整合病毒（如腺病毒）或质粒携带方式由于不存在插入突变等问题，在转分化的应用中更具优势。② 微RNA（microRNA，miRNA）诱导：miRNA通过转录后调控基因表达从而诱导转分化［13］。Yoo等［14］发现，过表达miR-9/9＊和miR-124可实现人成纤维细胞向神经细胞的转分化。但是miRNA单独作用时转分化效率较低，而同时过表达转录因子和miRNA将极大提高转分化效率。③小分子化合物诱导：小分子化合物能通过调控DNA和组蛋白的表观遗传修饰进而调控基因表达谱从而实现细胞转分化［12］。小分子化合物诱导能避免基因操作所带来的安全隐患，理论上是一种更适用于临床推广的、相对安全有效的诱导方式。2014年，裴钢实验室［15］同时使用3种小分子化合物组蛋白去乙酰化酶抑制剂丙戊酸（valproic acid，VPA）、GSK3抑制剂CHIR99021和TGF-β抑制剂Repsox将小鼠成纤维细胞转分化为神经前体细胞。2015年，Li等［16］使用4种小分子化合物将小鼠成纤维细胞成功转分化为成熟的神经元。随后，研究者们使用多种小分子化合物组合成功诱导出不同的神经元亚型。并且，转录因子配合添加小化合物可很好地提高转分化效率。

2 转分化在神经退行性疾病中的研究现状

神经退行性疾病是由神经元及其髓鞘功能缺失导致的一类神经系统疾病，病症随时间推移日渐加剧。根据发生病变的脑区和神经元的种类不同，神经退行性疾病分为多种类型，如帕金森病（Parkinson disease，PD）、阿尔茨海默病（Alzheimer disease，AD）、亨廷顿舞蹈病（Huntington disease，HD）和肌萎缩侧索硬化病（Amyotrophic lateral sclerosis，ALS）等［17］。目前针对此类疾病的治疗多是通过药物或手术控制病症发生进程，并不能从根本上达到治疗或治愈的效果。21世纪以来，转分化技术迅猛发展为神经退行性疾病临床治疗提供新方案，给深受神经退行性疾病困扰的患者及家庭带来曙光。

2.1 帕金森病

PD是一类由于中脑黑质致密部多巴胺能神经元变性而导致的神经退行性疾病，多发生于中老年，临床表现为静止性震颤、僵直、运动缓慢和步态异常，并伴随不同程度精神异常。发病早期临床常用左旋甲基多巴控制疾病进程［18］，中晚期则是以对症治疗药物为主，力求缓解患者的运动症状及一系列其他并发症，但临床上并无有效手段治疗或治愈PD。随着细胞治疗研究的深入，利用转分化技术获得目的细胞替换受损神经元成为PD研究热点。目前，研究者们已成功将成纤维细胞和星形胶质细胞等转分化为多巴胺能神经元，试图探究治疗PD的新途径。2011年，Pfisterer等［19］报道，过表达转录因子Achaete-scute复合体同源基因1蛋白（Achaetescute complex-like 1，Ascl1）、POU家族蛋白结构或转录因子2（POU domain class 3 transcription factor 2，Brn2）、髓鞘转录因子 1样因子（myelin transcription factor 1-like，Myt1l）以及LIM同源框转录因子 1a（LIM homeobox transcription factor 1a，Lmx1a）和叉头框蛋白a2（forkhead box protein a2，Foxa2）能够将人成纤维细胞转分化为多巴胺能神经元。同年，Caiazzo等［20］发现，在转录因子Ascl1、核受体相关蛋白1（nuclear receptor related-1 protein，Nurr1）和Lmx1a作用下，可实现小鼠和人成纤维细胞向多巴胺能神经元的转分化。2011年，Addis等［21］通过过表达转录因子Ascl1，Nurr1和Lmx1b实现了小鼠星形胶质细胞向多巴胺能神经元转分化。而后，研究者设想能否直接在体内将非神经元细胞直接转分化为神经元，替补受损的神经元。2013年，Torper等［22］将人成纤维细胞和星形胶质细胞移植到大鼠脑中，在转录因子Ascl1、Brn2、Myt1l和多巴胺能神经元决定因子Lmx1a、Foxa2、Lmx1b、同源盒基因蛋白2（orthodenticle homeobox 2，Otx2）的共同作用下移植的细胞能够转分化为多巴胺能神经元。但存在转分化效率低、多巴胺能神经元功能欠佳等问题。2015年，Park等［23］通过建立药物诱导转分化体系获得诱导型多巴胺能神经元，其功能与内源性细胞更接近。同年，Jiang等［24］报道，抑制p53表达，调控细胞周期，外加合适的微环境，能显著提高人成纤维细胞向多巴胺能神经元转分化的效率。Yoo等［25］近期发现，电磁金属纳米颗粒在电磁场作用下能显著提高小鼠或人成纤维细胞向多巴胺能神经元转分化的效率，该转分化过程离不开APLN〔Ascl1、同源盒域转录因子3（paired-like homeodomain transcription factor 3，Pitx3）、Lmx1a和Nurr1〕的诱导。而且，电磁金属纳米颗粒结合APLN能促进PD小鼠体内星形胶质细胞转分化为多巴胺能神经元，并显著改善小鼠的运动行为。随着研究的深入，转分化技术应用于PD的临床治疗将在不久的将来实现。

2.2 阿尔茨海默病

AD是一种以进行性认知功能减退和非认知性精神症状为主要临床表现的老年退行性疾病，伴随着神经元和突触丢失，其主要病理特征是tau蛋白形成的神经元纤维缠结和由β淀粉样蛋白（β-amyloid，Aβ）沉积构成的老年斑［26］。目前临床尚无有效治疗AD的药物。研究人员正试图通过转分化来获得替补的功能神经元，已达到治疗AD的目的。早在2002年已有报道，皮质来源的胶质细胞在转录因子Pax6作用下能转分化为神经元［9］，随后陆续不断有研究发现在转录因子或miRNA等的作用下，人或小鼠成纤维细胞可转分化为神经干细胞、神经前体细胞或不同类型的神经元亚型。2014年，Guo等［27］探究了AD疾病模型下转分化作用，他们以5xFAD小鼠为模型将携带神经分化因子1基因（neurogenic differentiation factor 1，NeuroD1）的逆转录病毒注入小鼠大脑皮质中，发现活化的胶质细胞能转分化为谷氨酸能神经元和GABA能神经元，且相互之间能形成自发性的突触联系。2015年，Hu等［28］利用小分子化合物将正常和AD患者的成纤维细胞转分化为神经元，发现AD患者来源的神经元中的Aβ42以及Aβ42/Aβ40的比例均高于正常人来源的神经元。此外，通过转分化建立有效的疾病模型来探究AD的发病机制是目前AD研究的新思路。如Kim等［29］在小鼠或人成纤维细胞中过表达转录因子Ascl1、Brn2、Myt1l以及药物诱导获得了淀粉样前体蛋白（amyloid precursor protein，APP）突变的神经元，并在该神经元中探究了散发性AD关键基因载 脂 蛋 白 E ɛ3/4（apolipoprotein E gene ɛ3/4，APOE ɛ3/4）对APP剪切的影响，而将APOE ɛ3/4患者转分化的神经元和正常人转分化的神经元进行测序分析发现，APOE ɛ3/4和另一个AD关键基因桥粒芯蛋白2（desmoglein-2，Dsg2）之间存在关联。

2.3 亨廷顿舞蹈病

HD是一种由亨廷顿（Huntingtin，HTT）基因突变导致的常染色体显性神经退行性疾病，生理表征为患者纹状体中型棘突神经元（medium spiny neurons，MSN）异常，临床表现为进行性的运动、认知及精神障碍。目前，主要采取传统药物和物理治疗控制其运动行为，尚无针对HD的治愈方案，但近年来的转分化研究成果给HD患者带来了希望。Victor等［30］发现，过表达纹状体发育关键转录因子B细胞白血病/淋巴瘤 11b（B cell leukemia/lymphoma 11b，Bcl11b）、同源盒转录因子（distal-less homeobox，Dlx1）、Dlx2、Myt1l和在miR-9/9＊、miR-124的作用下，人成纤维细胞能转分化为MSN，单细胞测序分析显示该诱导型MSN与內源MSN的基因表达图谱高度一致，同时，研究者还检测了诱导型MSN的生理功能。而后，他们将MSN移植到小鼠纹状体中发现，诱导型MSN能存活长达6个月之久，更为关键的是该类神经元能参与到纹状体环路中。此研究不仅首次获得了诱导型MSN，而且还深入研究了该MSN在移植后的生理功能，为今后转分化在HD治疗上的应用开启了一个良好的开端。

2.4 肌萎缩侧索硬化病

ALS是一种进行性运动神经元疾病，分为遗传性和散发性2种，生理表征为额叶皮质、脑干以及脊髓前角运动神经元病变；临床症状为四肢肌肉进行性萎缩、无力，吞咽困难，最终常因呼吸衰竭而死亡，病程一般为2～5年。唯一国际认可并通过美国FDA认证的治疗ALS的临床用药力如太（riluzole），还有一些药物正处于临床试验阶段，但是这些药物均不能促进神经元再生，因此人们寄希望于转分化。2011年，Son等［31］最先报道，小鼠成纤维细胞中过表达7个转录因子Ascl1、Brn2、Myt1l、神经生长因子2（neurogenin-2，Neurog2）、LIM同源框蛋白质（LIM/homeobox protein，Lhx3）、LIM同源域蛋白家族转录因子胰岛素基因增强蛋白（insulin gene enhancer protein，Isl1）和同源盒基因（homeobox，Hb9）诱导转变为运动神经元；而过表达上述7个因子和NeuroD1可将人成纤维细胞转分化为运动神经元。进一步研究显示，该诱导型运动神经元与小鸡肌管细胞在体外共培养能形成神经肌肉接头，将运动神经元转移到小鸡脊髓中后，可见其轴突延伸到周围组织中。此外，研究者们将转分化获得的诱导型运动神经元分别与野生型和SOD1G93A（ALS模型）胶质细胞共培养，发现后者能显著降低诱导型运动神经元的存活率［31］。Meyer等［32］也发现，由散发性或遗传性ALS患者皮肤成纤维细胞转分化获得的星形胶质细胞均能降低运动神经元的存活。这引发人们对ALS临床治疗的思考，ALS患者的星形胶质细胞会抑制运动神经元的存活，单纯移植运动神经元可能不能达到理想的治疗效果。2016年，Liu等［33］将ALS患者皮肤成纤维细胞转分化为运动神经元，表现出低存活率、胞体固缩、电生理功能减退及不能形成神经肌肉接头等病理特征。但值得高兴的是，他们通过药物筛选发现，Kenpaullone能改善ALS运动神经元退行性病变症状。这些结果提示，因疾病微环境影响，单纯移植运动神经元可能不能达到治疗ALS的目的，有待开发更优化的治疗方案。

3 转分化在创伤性中枢神经损伤中的研究

根据发生部位不同中枢神经损伤可分为创伤性脑损伤（traumatic brain injury，TBI）和脊髓损伤（spinal cord injury，SCI）；根据发病原因不同可分为原发性损伤和继发性损伤。原发性损伤是机械损伤直接造成组织损伤，神经元死亡。继发性损伤是由于局部组织环境破坏造成的神经元持续死亡，继而出现脱髓鞘、胶质瘢痕等症状。目前，临床上主要常用手术和药物治疗等手段控制病情发展，但神经元大量死亡和胶质瘢痕形成使治疗难以达到预期效果。将胶质瘢痕的星形胶质细胞转分化为功能性神经元以弥补丢失的神经元无疑是一举两得的治疗策略。2012年，Corti等［34］发现，体外过表达Oct4、Sox2、同源域蛋白NANOG可将人皮质星形胶质细胞转分化为神经干细胞，移植体内后可进一步分化为神经元。2013年，Niu等［35］报道，转录因子Sox2能将小鼠脑内的星形胶质细胞转分化为DCX+神经母细胞，且能存活数月之久，添加脑源性神经营养因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）和头蛋白（noggin）或VPA可将该神经母细胞诱导分化为成熟的神经元并整合到神经环路中。Su等［36］利用小鼠SCI模型，直接在胶质瘢痕的星形胶质细胞中过表达Sox2，成功获得DCX+的神经母细胞，在VPA作用下获得成熟的神经元。Wang等［37］对此过程进行机制研究发现，p53通过调控细胞周期进程而控制星形胶质细胞转变为DCX+神经母细胞的数量，敲低p53能显著提高转分化效率，获得更多的DCX+神经母细胞。整个体系从在体细胞转分化到疾病模型下的功能研究，再到疾病模型中转分化条件优化，这为在体转分化应用于临床治疗打下了良好的基础。2014年，Guo等［27］建立脑损伤模型，并发现NeuroD1能使皮质中激活的星形胶质细胞转分化为功能性神经元。2015年，Kim等［38］报道，过表达Oct4可使小鼠成纤维细胞转分化为少突胶质前体细胞，后者无论在体外还是体内都能继续分化为少突胶质细胞和星形胶质细胞。他们将少突胶质前体细胞移植到SCI模型小鼠中后，主要分化为少突胶质细胞，促进髓鞘再生，完成损伤处的修复。此外，Gascón等［39］证实，过表达Bcl2、Ascl1和维生素E等因子或抗氧化处理能促进创伤性脑损伤中胶质细胞向神经元的转分化。

4 转分化在神经精神障碍疾病中的研究

孤独症和抑郁症等神经精神障碍疾病严重影响人们的生活质量。研究发现，其发病多与5-羟色胺神经元功能异常相关。Xu等［40］报道，过表达Ascl1、Foxa2、Lmx1b及第五Ewing变体蛋白（fifth Ewing variant，FEV）可将人成纤维细胞转分化为具有生理功能的5-羟色胺神经元，但存在转分化效率低，转分化获得5-羟色胺神经元数量少的问题。研究发现，敲低p53基因并改善合适的培养条件能提高转分化效率。此外，研究者们还通过建立有效的鉴别方法成功从转分化复杂多样的神经元类型中分离出5-羟色胺神经元。为该技术今后应用到临床治疗神经精神障碍疾病奠定了基础。

5 结语

目前，转分化在神经系统疾病治疗中的应用主要有2种策略。①体外转分化获得目的细胞进行细胞移植。理论上转分化获得功能性神经元并移植是弥补神经元损伤最为直接有效的方式，但是，成体神经元不具备分裂增殖的能力，转分化细胞获得量有限且移植后神经元的存活率和整合率较低，给临床治疗带来困难。鉴于此局限性，研究者倾向于将体细胞转分化为具有增殖和分化能力的神经干细胞或神经前体细胞进行移植。而因神经干细胞在移植后多分化为星形胶质细胞而非功能性神经元，且可能存在成瘤风险，所以临床应用有限。而神经前体细胞既具有增殖又能定向分化为特定的神经元，目前被认为是理想的细胞移植供体，利用易于获取的体细胞直接诱导转分化为神经前体细胞将成为细胞移植研究的趋势。②体内转分化将机体病灶部位的神经细胞直接转分化为功能性神经元，避免了细胞移植可能造成的二次受伤，是临床应用前景良好的神经系统疾病治疗新思路。目前人们已在动物模型上进行了大量的研究并取得可喜的成绩。除此之外，转分化还是疾病机制研究及药物筛选的重要手段，通过获取患者的体细胞进行体外转分化构建疾病模型，既能真实还原疾病发生表型，有助于揭示疾病的发生发展机制，又可开发药物筛选体系。

转分化应用于临床治疗虽规避了胚胎干细胞和多能性干细胞的分化方向难以控制、伦理道德以及致瘤性等问题，但仍然存在一定的安全问题。如转分化诱导因子通常是与细胞增殖、细胞周期调控相关分子，存在过度表达导致细胞周期紊乱等风险；而携带诱导基因病毒载体进入细胞存在安全隐患。此外，转分化效率是其应用于临床的限速步骤。解决这些问题将极大推进转分化应用于临床神经系统疾病治疗的步伐。我们相信，在科研工作者的不懈努力下，转分化应用于临床神经系统疾病治疗指日可待，一个个医学难题势必将被攻克。

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