ITS2二级结构系统发育信息在茄属药用植物DNA条形码鉴定中的应用价值

杨烁+薛渊元+李美慧+赵奉熙+赵宏+张伟

[摘要]ITS2是中药鉴定的核心DNA条形码之一，基于ITS2的中药鉴定方法已被纳入《中国药典》，但分辨力不足仍是制约其推广应用的主要因素，因此需要进一步挖掘其有助于中药鉴定的遗传信息。在细胞内，ITS2以二级结构形式发挥功能，这种结构所蕴含的丰富遗传信息是核酸序列所无法体现的。该研究以茄属Solanum 26个物种的40个样本为研究对象来探究ITS2二级结构在茄属药用植物鉴定中的价值。作者利用PicXAA-R，MASTR和LocARNA软件来比对二级结构，利用RNAstat软件将二级结构信息转为系统发育信息，最后利用最大简约法进行建树分析。研究结果表明将ITS2二级结构转化为系统发育信息后信息位点增加了88.57%，物种关系树上50%，75%，90%以上支持率的支系分别增加了19.05%，66.67%，66.67%，从而很好地解决了茄属几种药用植物的鉴定问题。鉴于以上结果，作者建议将ITS2二级结构信息作为系统发育信息的有益补充加入到目前DNA条形码分析中。

[关键词]DNA条形码； ITS2二级结构； 药用植物； 茄属

[Abstract]Internal transcript spacer 2 （ITS2） is one of the broadly used standard core barcodes and also the only nuclear barcode in identification of Chinese traditional medicine. Although the DNA barcode method based on ITS2 is popular and has been used in Chinese Pharmacopoeia， its low discriminatory efficiency is still a problem to its extensive application. Therefore， further study is still necessary to explore its phylogenetic information for medicinal plants identification. In cells， ITS2 activity is based on its secondary structure. The secondary structures are particularly useful in phylogenetic analysis because they include information not found in the primary sequence. In this study ITS2 secondary structure of 40 samples from 26 species were predicted and used to explore their utility in addressing the identification problems of Chinese traditional medicine in Solanum. The secondary structures were predicted and aligned， and their consensus models were generated using the three different software of LocARNA， MASTR and PicXAA-R. RNAstat software was used to transform the secondary structures into 28 symbol code data for maximum parsimony （MP） analysis. The results showed that the phylogenetic information increased 88.57% after ITS2 secondary structure information has been added， and then the support values above 50%， 75% and 90% in the tree increased 19.05%， 66.67% and 66.67%， respectively， indicating that the identification of Solanum medical plants has been well resolved. Thus， our analysis suggests that ITS2 secondary structure information should be incorporated into the current DNA barcoding analysis as a beneficial supplement of phylogenetic information.

[Key words]DNA barcode； ITS2 secondary structure； medical plants； Solanum

DNA條形码技术作为一种新兴的分子鉴定技术，近年来受到广泛的关注。该技术是利用一种短而标准的DNA片段对物种进行快速而准确鉴定的方法^[1-2]。由于它不受物种的形态学特征及发育阶段的限制，且准确性较高，在药用植物鉴定中备受关注。ITS（internal transcribed spacer）具有进化速率快、易于扩增、通用性好和双亲遗传等优点，已成为植物系统发育与进化研究中最重要的分子标记之一^[3-5]。ITS2是ITS系统发育信息的主要来源，它在物种水平甚至种下水平都具有明显的序列变异，具有更高的系统发育学价值，因此被建议作为种子植物、真菌物种鉴定的DNA条形码^[6-8]。在药用植物鉴定中基于ITS2的药用植物鉴定方法已被《中国药典》收录^[9]。尽管ITS2作为DNA条形码有诸多优点，然而它还不能像COI在动物中那样成为物种鉴定的理想DNA条形码，主要原因是分辨力依然较低^[10]。提高分辨率的传统做法是增加单一DNA片段的长度或片段组合数，然而这种方法费时费力，更重要的是随着基因片段的增加，PCR成功率呈几何倍数下降^[11-12]，不适用于像中药材这样DNA容易降解的材料。因此，如何在不增加片段长度的情况下提高DNA条形码的分辨率是解决问题的关键。

以往的DNA条形码研究大多基于ITS2一级结构（碱基替换信息），近年来有关ITS2二级结构的研究与应用逐渐被报道^[13-17]。它是由RNA单链自身回折而形成的配对和未配对碱基交替而成的茎环结构，这为核糖体的剪切、正确组装与成熟提供了必需信号^[18]。这种生理结构的形态和进化特征是核酸序列所不能体现的，它们蕴含着潜在的系统发育信息^[19-21]。早在20世纪80年代就有RNA二级结构在系统发育中的价值研究^[22]。然而由于当时难以获得和比对RNA二级结构并没有引起足够重视。随着生物信息学的发展，关于RNA二级结构预测的算法大量涌现^[23-26]。在二级结构的比对方面也有诸多的算法和软件^[27-29]，特别是基于共有结构来比对长RNA的快速算法，如MRNA^[30]，MXSCARNA^[31]，R-Coffee^[32]以及近年来出现的最大期望精确度算法（maximum expected accuracy，MEA）^[33]大大提高了序列二级结构的准确性和运算速度。这些算法和运算软件的发展为挖掘ITS2二级结构系统发育价值提供了技术保障。

茄属Solanum L.植物广泛分布于热带及温带地区，是药用植物资源利用历史较早且物种丰富的类群。该属除了茄S. melongena L.、白英S. lyratum Thunb、龙葵S. nigrum L.被载入《中国药典》之外，还有很多民间传统中药资源，如欧白英S. dulcamara L.、少花龙葵S. americanum Miller、澳洲茄S. laciniatum Aiton、珊瑚樱S. pseudocapsicum L.等。茄的果实与叶片均含有葫芦巴碱，有显著的抗癌作用，茄根有散热消肿，止血的功效，用于治疗久痢便血、脚气、冻疮等^[34]；白英全草入药，用于风热外感，发热咳嗽，湿热黄疸等，外用于风湿痹痛等；龙葵全草有清热解毒、利水消肿的功效，用于治疗小便不利、疮痈肿毒等^[35]。这3种植物均为传统中药材，由于它们的应用历史久远、本草记载的植物来源不一、植物分布和药材产地较广、地方用药习惯不同等原因，使得这些药材与其替代品之间相互混用现象严重。这种混乱的现象严重影响了药材的使用安全。然而由于正品和替代品之间形态特征非常相似，传统的鉴定方法难以对它们进行快速而准确的鉴定。

本研究将ITS2二级结构的系统发育价值与DNA条形码研究结合，并将其应用到茄属常见中药材的分子鉴定上，拟解决以下问题：①比较目前有关ITS2二级结构预测和比对的经典或最新方法，根据预测的准确性评估出最适用于DNA条形码的方法；②比较ITS2核酸序列信息、ITS2二级结构信息以及ITS2核酸信息和二级结构信息联合分析在茄属药用植物DNA鉴定中支持率和鉴定效率的差别，搞清楚ITS2二级结构是否能够以及在多大程度提高物种鉴定效率。在此基础之上为相关药用植物的DNA条形码鉴定提供方法参考。

1 材料

本研究选取了茄属中部分具有药用价值的物种，包括药典收录的白英、茄、龙葵及其近缘种，一些民间药用植物，以及茄属不同进化支系上的代表物种^[36]，共计26种，40样本（表1）。

2 方法

2.1 ITS2序列的获取及比对

从GenBank上下载相关物种的ITS序列，根据GenBank基因注释信息或隐马尔可夫模型（HMMs）^[37]识别出ITS2的区域，去除在3′端和5′端的5.8S和26S rDNA序列，获得完整的ITS2序列。利用Clustal X软件对ITS2序列进行序列对比，比对结果使用Bioedit 7.0.5进行人工校正。

2.2 ITS2二级结构的预测、二级结构比对及比对方法评估

本研究分别选取了最新的RNA二级结构非渐进式的算法MASTR^[38]，最大期望精确度算法PicXAA^[39]，以及RNA二级结构比对中经典的LocARNA算法^[40]。MASTR和PicXAA软件具有二级结构生成和二级结构比对的双重功能，将ITS2核酸序列矩阵的Fasta格式输入后可直接产生各个序列二级结构的共有模型。本研究还使用了LocARNA二级结构比对功能，利用软件Mfold^[41]或网站ITS2 database二级结构预测在线服务器（http：//its2-old.bioapps.biozentrum.uni-wuerzburg.de/cgi-bin/index.pl？custom）将核酸序列折叠成二级结构后，再将核酸序列和二级结构联合矩阵输入到LocARNA进行二级结构比对。 比较3种方法获得的二级结构模型，筛选出最优模型。

2.3 二级结构信息编码和系统发生分析

利用Subbotin等^[42]提出的RNA二級结构28字符编码法（图1），即将螺旋中的4种碱基分为6种状态（如AA，AC，AG，AU，A-，-A），同时将环上的4种碱基状态作为额外特征一起考虑，一共得到28种碱基编码，通过软件RNAstat将ITS2二级结构转化为结构信息矩阵。使用PAUP4.0b10中的最大简约法（maximum parsimony，MP）对ITS2核酸信息、ITS2二级结构信息分别进行单独和联合系统发育分析。分析参数设置为启发式搜索随机重复1 000次，TBR分枝交换法获取系统树，选择多重树（multrees）选项。自举分析1 000次重复以检测分支的可靠性。利用PAUP4.0b10中的数据同质性检验（ILD test）模块对核酸序列和其二级结构的系统发育信息的一致性进行评估。

3 结果

3.1 序列矩阵

3.1.1 3种二级结构比对软件产生的结果比较 3种二级结构比对软件产生了40条ITS2核酸序列的二级结构共有模型，都为茎环结构模型。其中LocARNA产生了典型的一环四臂结构，其中臂Ⅲ最长，臂Ⅱ最为保守，臂Ⅳ保守位点最少、变异最大。在碱基组成上LocARNA产生的二级结构也表现出了规律性：臂Ⅱ有一个嘧啶组成的鼓凸（bulge），臂Ⅲ有一段TGGT的共有序列（sequence motif），在臂Ⅰ和臂Ⅳ之间的大环富含嘌呤，这些特点都符合ITS2二级结构在植物中的共有特征^[44]。除此之外，在茄属还有一些特征性共有序列，如臂Ⅰ上的UCCG，GCC序列，臂Ⅱ上的CCGUG序列，臂Ⅲ上GUCGCGGC序列（图2A）。MASTR和PicXAA产生的二级结构共有模型只显示了结构，没显示核酸组成。PicXAA也产生了一环四臂的ITS2二级结构基本式样，然而由于碱基配对过度严谨，大环上6～9，118～121位点处进行了互补配对打破了大环的整体结构（图2B）。MASTR产生的二级结构共有模型为一环三臂类型（图2C）。除此之外由于对每条序列插入/缺失处理不一样，使得排列后矩阵的长度不一样，LocARNA，MASTR，PicXAA排列后序列矩阵的长度分别为237，255，228 bp，与之对应的是各个臂上鼓凸的数量也有所不同。由于ITS2在植物中一环四臂的基本结构已被证实^[45]，因此LocARNA产生的运算结果较准确。

3.1.2 常规序列比对软件与LocARNA序列比对软件产生的结果比较 作者将常规序列比对软件Clustal X对ITS2的序列比对结果（图3A）与基于ITS2二级结构比对产生的矩阵（图3B）进行了比较，发现两者存在一些差别。首先两矩阵的长度不一样，Clustal X产生的矩阵长度为248 bp，ITS2二级结构比对产生的矩阵长度为237 bp。这是由于它们插入/缺失的位置不同，因此它们产生的信息位点也不一致（表2）。由于二级结构形式是ITS2在细胞内的存在形式，而常规软件所假定的计算模型都是序列线型形式，因此基于ITS2二级结构比对的运算结果更能反应序列差异的真实状态。

3.2 系统学分析

3.2.1 ITS2二级结构发育信息与核酸序列系统发育信息比较 ITS2二级结构由RNAstat编码，共生成了169个碱基位点，包括111个变异位点和61个简约位点。MP分析共产生106棵最短树，每棵树的步长均为265，CI为0.713 2，RI为0.836 6。作者将ITS2二级结构编码信息构建的严格一致树与核酸序列信息构建的严格一致树进行了比较，发现两者拓扑结构几乎一致（图4），ILD测试结果也表明，在序列数据与结构数据间没有明显的系统发育信息冲突（P=1.00），因此作者将这2组数据结合到一个数据集中，联合矩阵中共406个位点，包括227个变异位点和132个简约位点，与核酸常规序列比对算法（Clustal X）产生的矩阵相比信息位点增加了88.57%。联合矩阵共计生成2棵步长为513的最短树，其CI为0.690 1，RI为0.830 5（表2），这表明二级结构信息的加入在没有显著改变数据的异质性的情况下大大提高了信息位点的数量。

3.2.2 系统发育关系与物种鉴定结果 ITS2核酸序列与其二级结构编码的信息联合分析产生了一棵严格一致树，该树图与常规使用的核酸信息相比解决了更多的种间关系。如在核酸信息构建的关系树图上龙葵、红果龙葵S. villosum和少花龙葵3个近缘种之间的亲缘关系没有得到解决（图5A），而加入ITS2二级结构系统发育信息后3个物种之间的关系得到了很好的解决（图5B）。此外，ITS2核酸信息和二级结构信息联合分析显著提高了某些支系的支持率。如在核酸信息构建的树图上大于50%（低度及以上支持）、75%（中度及以上支持）和90%（高度支持）的支系分别为21，9，6个（图5A），而在联合二级结构信息构建的树图上相应的支系分别为25，15，10个。在该树图上传统中药龙葵与茄的不同个体自成单系，能够与它们各自的近缘种区分出来。而白英与其近缘种欧白英、千年不烂心S. cathayanum相互嵌合在一起，并未区分开，研究结果提示需要在经典分类上对这3个种进行进一步的修订（图5B）。

4 讨论

茄属有1 400余种，是一个进化复杂、经典分类混乱的类群，前人曾尝试对该类群进行DNA条形码鉴定工作，但并未得到理想效果^[46]。本研究将ITS2二级结构作为条形码鉴定信息的有益补充应用到该类群部分药用植物的鉴定上，研究结果表明这种信息可有效提高支系的支持率和物种的鉴定效率。中药材经过加工、长时间储存之后DNA容易降解，因此后续的DNA提取和PCR扩增十分困难。因此传统上使用增加单一DNA片段的长度或片段组合数来提高物种分辨率的做法，并不适合中药材。本研究将ITS2二级结构信息转化成了系统发育信息，在没有增加片段长度的情况下提高DNA条形码的分辨率，这为药用植物DNA条形码鉴定率低的难题提供了解决思路。ITS/ITS2是植物系统发育研究使用最多的分子标记之一，也是中药材分子鉴定的核心DNA条形码，目前GenBank已有海量的ITS2数据，若有效利用ITS2二级结构信息可进一步促进分子系统学、DNA条形码鉴定等相关学科的发展。

虽然二级结构的系统发育价值在20世纪80年代就被提出和研究，但是大规模利用该信息还需要澄清和解决一些难题。一个核心问题是如何比对和编码二级结构，随着生物信息学的发展，关于基因的二级结构比对的方法越来越多，出现了几个不同的学派，例如德国的Wolf研究组、美国的Subbotin研究组和Coleman研究组，这些学派使用的分析方法均有不同。影响较大的Wolf研究组使用的4SALE比对方法是将ITS2核酸信息及其二级结构作为整体比对产生编码信息^[47]，而本研究所使用的Subbotin的28字符编码法可以将二级结构信息单独编码转化成系统发育信息，并综合比较了ITS2核酸序列信息、二级结构指导排列的核酸序列信息、ITS2二级结构信息以及ITS2核酸信息和二级结构信息联合分析，可用于比较的系统发育信息更丰富，是一个很好的尝试。此外，本研究所使用的MASTR，PicXAA，LocARNA这3种方法是目前最新的或最经典的二级结构比对方法，通过对比检验，本研究确定了最佳的LocARNA方法。这种方法不仅适用于ITS2序列，也适用于其他具有二级结构的系统发育分析分子标记，因此该方法可能比4SALE更有价值。另一个核心问题是数据的处理问题。在分子系统学中，目前广泛使用的核酸信息是基于碱基的变异和排列，而对碱基变异的假设是独立和随机的^[48]。二级结构的维持是通过碱基的相互作用，例如规范的配对AU，GC，不规范的配对GU，不稳固的AC，以及稀有的GA，AA^[49-50]。在核酸发生变异时，一侧碱基突变后，另一侧与它互补的碱基也常常发生相应的替换（这可能与维持二级结构的稳定性有关），这种现象为碱基补偿替换（compensatory base changes，CBCs）。如果一側碱基突变后，另一侧与它互补的碱基没有发生相应的替换，这种现象为半补偿性替换（hemi-CBC）^[51]。这种突变机制是目前的核酸所不具备的，而突变后碱基配对的方式也是核酸一级结构所无法体现的，因此二级结构信息包含着一级核酸序列所没有的额外的系统发育信息^[19，45]，充分挖掘这种信息可以获得更多的信息位点，从而解决更多物种的种间关系。然而，由于当前使用的JC69，K80，HKY85，GTR等分子进化模型不适用于ITS2二级结构的进化或碱基替代规律，因此依赖于进化模型的建树方法如最大似然法（maximum likelihood，ML），贝叶斯方法（Bayesian，BI）或邻接法（neighbour-joining，NJ）都不适合直接分析ITS2二级结构信息。鉴于上述原因，本研究利用了不依赖于分子进化模型的MP方法对ITS2二级结构系统发育分析做了很好的探索，然而后续研究需进一步探索ITS2二级结构的进化规律，以充分利用其分子变异信息。

基于ITS2序列信息构建的系统发育树显示白英、欧白英及千年不烂心并不能进行分子区分，而加上ITS2二级结构系统发育信息后也没有解决三者之间的关系和分类地位。这3个物种不仅形态学特征极其相似而且化学成分和药效也几乎相同^[52-53]，古代本草、现代药著乃至民间中药，经常将它们共同作为中药“蜀羊泉”、“白毛藤”或“苦茄”相互混用。如对“苦茄”的药源植物，《中药大辞典》认定为千年不烂心，而《中华本草》认定为欧白英。目前《Flora of China》将千年不烂心与白英合并为同一物种，而并未对欧白英进行分类处理。然而，曾经有研究认为白英是欧白英的一个变种^[54]。欧白英与白英形态学特征极为相似，差别仅在茎与叶上被毛的长短，而且对于两者的系统发生关系并没有明确的分子证据^[54]。本研究通过ITS2及其二级结构信息对欧白英与白英进行系统发生关系重建，首次为欧白英和白英间的系统发生关系提供了分子证据，支持将两者进一步合并的分类处理，研究结果为该类群后续进一步的分类修订提供了依据。

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[责任编辑 吕冬梅]