基于大鼠鼻腔灌流法筛选芍药苷经鼻给药制剂的吸收促进剂

朱智涛+潘金火+吴贤慧+蒋志涛

[摘要]该实验筛选了芍药苷经鼻给药制剂的吸收促进剂，建立了HPLC测定灌流液中芍药苷的方法，采用改良的大鼠鼻腔灌流模型，筛选吸收促进剂的种类和用量。为了避免鼻腔的分泌和吸收对灌流液体积的影响，采用体积校正法计算剩余药量，各时间点剩余药量的百分率取对数后与对应时间进行回归，回归直线的斜率即为吸收速度常数。结果显示，羟丙基-β-环糊精和水溶性氮酮能够显著提高芍药苷的鼻腔吸收，其中水溶性氮酮吸收速度常数最大，对芍药苷的促渗效果最好。当灌流液中水溶性氮酮的质量浓度由5 g·L^-1逐渐升高为20 g·L^-1时，吸收速度常数逐渐变大，20 g·L^-1时达到峰值；当其质量浓度增加至30 g·L^-1时，吸收速度常数变小，表明水溶性氮酮质量浓度为20 g·L^-1时促渗效果最好。

[关键词]芍药苷； 大鼠鼻腔灌流； 吸收促进剂； 水溶性氮酮

[Abstract]This experiment was aimed to screen the absorption enhancer for intranasal administration preparations of paeoniflorin. In this study， HPLC method for determination of paeoniflorin in perfusion liquid was established and the improved model of nasal perfusion in rats was used to screen out the species and amounts of absorption enhancer. In order to avoid the influence of the secretion and absorption of nasal cavity on the volume of perfusion fluid， the residual dose was calculated by using the volume correction method. Linear regression was carried out between the logarithm to the percentage of the residual dose and the corresponding time， and the slope of the regression line was exactly the absorption rate constant. Experimental results showed that hydroxypropyl-β-cyclodextrin and water-soluble azone can significantly improve the nasal absorption of paeoniflorin. Furthermore， water-soluble azone had the highest absorption rate constant and the best promoting penetration effect on intranasal administration preparations of paeoniflorin. It was also found that when the mass concentration of water-soluble azone in the perfusion liquid increased from 5 g·L^-1 to 20 g·L^-1， the absorption rate constant was gradually increased and peaked at 20 g·L^-1. When the mass concentration was increased to 30 g·L^-1， the absorption rate constant was decreased， indicating that the best mass concentration of water-soluble azone was 20 g·L^-1.

[Key words]paeoniflorin； nasal perfusion in rats； absorption enhancer； water-soluble azone

芍藥苷（paeoniflorin）是一种主要存在于毛茛科多年生宿根草本植物芍药Paeonia albiflora Pall.的根中的单萜类糖苷化合物，具有显著的镇痛、镇静、抗惊厥作用。此外，芍药苷还具有降温解热、抗炎、抗溃疡、抗氧化、抗凝血及调节血脂等作用^[1]。近年来随着研究的深入，发现芍药苷亦可作用于神经系统，对老年痴呆、帕金森病和脑缺血损伤都有一定的治疗作用，但是芍药苷经口服进入人体后生物利用度较低，不利于发挥药效^[2-5]。

研究表明存在着基于鼻腔到达中枢神经系统的通路，经鼻给药可绕过血脑屏障直接进入中枢神经系统，更好地发挥芍药苷在中枢的治疗作用^[6]。芍药苷水溶性较大，不易被鼻黏膜吸收，通过添加吸收促进剂可以增加芍药苷对鼻黏膜的穿透作用。本研究通过大鼠鼻腔灌流法比较羟丙基-β-环糊精、丙二醇、水溶性氮酮对芍药苷的促渗作用，筛选出吸收促进剂的种类和较佳用量，为今后芍药苷经鼻给药制剂的研究提供实验依据^[7]。

1 材料

Waters 2695高效液相色谱仪（沃特世公司），Waters 2998紫外检测器（沃特世公司），MS105DU电子分析天平（瑞士梅特勒公司），AY220电子分析天平（日本岛津），TGL-16C高速台式离心机（上海安亭科学仪器有限公司），BT100-2J蠕动泵（保定兰格恒流泵有限公司）。

芍药苷（纯度>90%，批号ZL1603021-SYG，南京泽朗生物科技有限公司），芍药苷对照品（供含量测定用，批号110736-201136，中国食品药品检定研究院），2-羟丙基-β-环糊精（批号20151111，国药集团化学试剂有限公司），水溶性氮酮（广州诗茗化工有限公司），丙二醇（分析纯，批号20141110，广东光华科技股份有限公司），磷酸二氢钾（色谱级，批号13121612226，南京化学试剂有限公司），甲醇（色谱纯，批号20160730066，山东禹王实业有限公司化工分公司），纯净水（杭州娃哈哈集团）。

SD大鼠，雄性，体重（230±20）g，上海杰思捷实验动物有限公司提供，许可证号SCXK（沪）2013-0006。

2 方法与结果

2.1 芍藥苷含量测定方法的建立

2.1.1 色谱条件 Hanbon C18 Hedera ODS-2色谱柱（4.6 mm×200 mm，5 μm），流动相甲醇-0.05 mol·L^-1磷酸二氢钾溶液（32∶68），检测波长230 nm，流速1.0 mL·min^-1，进样量10 μL，柱温30 ℃。该条件下，系统适应性良好，见图1。

2.1.2 线性关系考察 精密称定芍药苷对照品14.55 mg，置于25 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，得582.00 mg·L^-1的母液。精密量取一定量的对照品母液，用甲醇分别稀释为17.46，34.92，46.56，58.20，69.84，93.12 mg·L^-1对照品溶液。按2.1.1项下色谱条件进行测定，以芍药苷质量浓度（x）为横坐标，峰面积（y）为纵坐标，进行回归，标准曲线方程为y=15 018x-15 165，r=0.999 9，表明芍药苷在17.46～93.12 mg·L^-1与峰面积线性关系良好。

2.1.3 精密度考察 精密吸取质量浓度为58.20 mg·L^-1的对照品溶液，重复进样测定6 次，测定峰面积的RSD为0.46%，表明仪器的精密度良好。

2.1.4 稳定性考察 以空白鼻灌流液配制质量浓度为50 mg·L^-1的芍药苷溶液，在37 ℃恒温水浴中平衡，分别于0，2，4，6，8，12 h时12 000 r·min^-1离心10 min，吸取上清进样测定峰面积，RSD为0.23%，表明鼻灌流液中芍药苷的稳定性良好。

2.1.5 重复性考察 以空白鼻灌流液配制6份质量浓度为50 mg·L^-1的芍药苷溶液，12 000 r·min^-1离心10 min，吸取上清进样测定峰面积。芍药苷的RSD为1.4%，表明重复性良好。

2.1.6 回收率实验 分别于空白鼻灌流液中加入芍药苷对照品适量，制成含芍药苷分别为29.41，58.82，77.40 mg·L^-1的样品溶液，各3份，12 000 r·min^-1离心10 min，吸取上清液进样测定，平均回收率分别为为103.5%，98.37%，100.6%，RSD分别为1.2%，0.44%，2.3%。

2.2 大鼠在体鼻腔灌流实验

2.2.1 灌流液的配制 精密称取芍药苷和吸收促进剂，加生理盐水配制成50 mg·L^-1芍药苷灌流液。

2.2.2 鼻腔灌流 选择质量（230±20）g的SD雄性大鼠，腹腔注射水合氯醛麻醉，仰卧，固定四肢于鼠板上进行手术，切开颈部皮肤暴露气管和食管。于气管后部切口插入聚乙烯管并结扎固定，以供大鼠正常呼吸。再取一根聚乙烯管通过食道前部切口插入直至鼻腔底部。将鼻腔至口腔的鼻腭通道用胶黏剂封闭，以防灌流液从鼻腔流入口腔之中。将插入食道的聚乙烯管暴露在外的一端与蠕动泵硅胶管连接，硅胶管另一端插入灌流液，依靠蠕动泵使灌流液通过鼻腔循环^[8]。

首先用生理盐水循环 10 min，比较循环前后的生理盐水体积，确定整个环路是否有漏液情况。排出生理盐水，取7 mL循环液置于10 mL量筒中，放置于37 ℃恒温水浴中加热，插入硅胶管开启蠕动泵，灌流液流速为2 mL·min^-1。待循环液从大鼠鼻孔中滴出开始计时，分别于0，10，20，30，45，60，90，120 min读取量筒中循环液体积V_N后取样0.2 mL，补加循环液0.2 mL，样品12 000 r·min^-1离心10 min，吸取上清液进样，测定各时间剩余药物浓度C_N。其中循环死体积为V₀=（7-V₁）。剩余药量Q_N采用体积校正法来计算。

式中Q_N为第N个时间点的剩余药量（μg），（V_N+V₀）为第N个时间点时循环液的实际体积（mL），C_N为第N个取样点测得的药物质量浓度（mg·L^-1），C₀为补加的循环药液的质量浓度（mg·L^-1）。

X=Q_N/Q₀

lnX=-Kt

通过不同时间点的剩余药量Q_N计算出各时间点剩余药量的百分率X，再取对数后与相对应时间t进行线性回归，回归直线的斜率即为吸收速度常数K，K的大小可反映芍药苷通过鼻腔的吸收情况^[9-11]。

按2.2.1项下配制灌流液，置于量筒中，37 ℃恒温水浴，将蠕动泵硅胶管插入灌流液中，进行体外空循环，于0，120 min取样测定，两时间点的芍药苷质量浓度没有变化。说明2 h内芍药苷在循环管路中基本不吸附。

2.3 吸收促进剂种类考察

按2.2.1项下配制的4份灌流液，其中3份分别加入适量羟丙基-β-环糊精、丙二醇、水溶性氮酮，使制得的3份灌流液中吸收促进剂质量浓度为都为20 g·L^-1。按2.2.2项下方法进行试验，结果见表1，图2。

结果采用t检验分析差异，加入羟丙基-β-环糊精和水溶性氮酮后能够显著提高鼻腔的吸收（P<0.05），丙二醇对芍药苷的鼻腔吸收无明显影响，其中水溶性氮酮吸收速度常数K最大，对芍药苷的促渗效果最好。

2.4 吸收促进剂用量考察

按2.2.1项下配制4份灌流液，分别加入不同质量浓度的水溶性氮酮。按2.2.2项下方法进行试验，结果见表2，图3。

结果显示当灌流液中水溶性氮酮的质量浓度由5 g·L^-1逐渐升高为20 g·L^-1时，吸收速度常数K逐渐变大，对芍药苷的促渗效果逐渐变强；当水溶性氮酮的质量浓度增加至30 g·L^-1时，吸收速度常数K有所变小，但与质量浓度为20 g·L^-1组相比，无显著性差异，表明水溶性氮酮质量浓度为20 g·L^-1时促渗效果最好。

3 讨论

芍药苷可作用于神经系统，对帕金森病和老年痴呆等神经退行性疾病有良好的神经保护作用以及较小的毒副作用。芍药苷口服利用度低，影响药效发挥，鼻腔给药则可使芍药苷直接通过鼻腔嗅上皮的双极嗅细胞沿嗅神经入脑，发挥中枢治疗作用。芍药苷的LogP<-0.3，为水溶性药物，不易被鼻黏膜吸收，需要添加吸收促进剂，增加芍药苷的吸收^[12]。前期实验结果显示，当灌流液中芍药苷质量浓度为100，150，300 mg·L^-1时，经灌流后芍药苷质量浓度无显著变化，故灌流液中芍药苷的质量浓度选择50 mg·L^-1。大鼠鼻黏液的pH为5.5～7.0，在进行实验时还需要考虑灌流液的pH对芍药苷鼻腔灌流实验的影响^[13]。经测定，2.3和2.4项下的8份灌流液pH都在5.5～7.0，不会对鼻黏膜产生刺激。

实验结果显示水溶性氮酮对芍药苷的促渗效果优于其他吸收促进剂，当其质量浓度为20 g·L^-1时效果最好。芍药苷为水溶性药物，透过鼻黏膜的主要障碍在于磷脂双分子层中的脂質成分。丙二醇作为渗透促进剂可以引起脂质移除，使得亲水性孔道打开，药物的透过量增加。但丙二醇单独使用时促渗效果并不是很好，故而对芍药苷的鼻腔吸收无明显影响。羟丙基-β-环糊精则是通过直接作用于生物膜，使得药物的渗透性增加，不存在药物与脂质间的可逆性交换^[14]。水溶性氮酮的作用机制是作用于细胞的类脂质双分子层，增加流动性，从而提高药物的渗透性。水溶性氮酮质量浓度为20 g·L^-1时促渗效果好于30 g·L^-1时的促渗效果，提示水溶性氮酮的促渗效果与浓度相关，在一定浓度时有促渗峰值，低于或高于此浓度时，则促渗效果都会减弱。本实验目的是筛选出一种适合芍药苷经鼻给药制剂的吸收促进剂，改善芍药苷的鼻腔吸收，有关实验显示芍药苷的吸收呈浓度依赖型增加，推测其在鼻腔中的吸收可能是被动扩散^[15]。本实验筛选出水溶性氮酮作为吸收促进剂，其对水溶性药物的促渗作用较强，毒性低、安全性高。同时还确定了水溶性氮酮的较佳用量，为今后芍药苷经鼻给药制剂的研究提供了实验依据。

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[责任编辑 孔晶晶]