热毒宁注射液物理指纹谱研究及应用

伍蕊嗣+刘涛+覃盼盼+雍玲+寇强+郑燕

[摘要]基于药品的物理化学性质与其安全性、有效性及稳定性具有很强的相关性，该研究提出建立热毒宁注射液物理指纹谱，提升其质量标准。采用物理化学的思路和方法对热毒宁注射液进行质量研究，构建由8个指标（酸碱度、电导率、浊度、折光率、渗透压摩尔浓度、表面张力、相对密度、运动黏度）组成的对照物理指纹谱，以雷达图直观展现，并对12批样品进行验证。发现3批效期内的热毒宁注射液，其物理指纹谱符合要求，相似度高于0.999；另外过期的9批样品，其物理指纹谱不满足要求。结果表明物理指纹谱法可用于控制热毒宁注射液的质量，对中药注射液质量评价研究具有一定的示范作用。

[关键词]热毒宁注射液； 物理指纹谱； 物理化学； 质量标准

[Abstract]The method of physical fingerprint spectrum for Reduning injection （RI） was proposed in this paper to improve its quality standards based on the strong correlation between physicochemical properties of drugs， their safety， effectiveness and stability. The quality of RI was studied by the thought and method of physical chemistry. The physical fingerprint spectrum was visually showed by the radar map， and consisted of eight indexes （pH， conductivity， turbidity， refractive index， osmolarity， surface tension， relative density， and kinematic viscosity）. Then 12 batch of samples were verified. It was found that the physical fingerprint spectra of 3 batches of RI were in line with the standards within their validity time， with similarity above 0.999； in addition for the expired 9 batches of RI， their physical fingerprint spectra did not meet the standards. The results showed that physical fingerprint spectrum can be used for the quality control of RI， with a certain exemplary role in the quality evaluation of traditional Chinese medicine injection.

[Key words]Reduning injection； physical fingerprint； physical chemistry； quality standards

中藥注射液被广泛运用于临床并显示出很好的治疗效果^[1]。纵观相关技术要求，在中药指纹图谱应用于中药质量控制之前，中药注射液质量控制体系的核心是化学成分定性定量控制，在此思想的指导下，我国中药注射液的药学研究论文均着重对其所含的化学成分进行分离、鉴定及含量测定，但是这些成分的含量高低与产品安全性及和有效性的相关性如何，尚无明确的研究结论。且中药化学对照品分离难度大、单体不稳定难以供应、供应价格高或由于检验太烦琐等原因，难以很好地应用到中药注射液实际质量监控和评价中^[2]。目前一些新的技术和方法如基于指纹图谱多指标成分定量研究^[3]、一测多评技术等被引入中药的质量评价中，但是上述方法目前存在一些缺陷，如指纹图谱的模糊性、校正因子使用的局限性等。

物理化学是从物质的物理现象与化学现象的联系入手来探求化学变化规律的一门科学^[4]，近年来，物理化学发展很快，分支较多，其中胶体化学、电化学、化学热力学及化学动力学等部分与药品的安全性、有效性及稳定性研究相关性很强，可用来对中药注射液的质量进行评价，如药液的黏度、药液中所含的离子的沉降速度等与产品质量的稳定性相关，药液中的电导率与药液中离子的含量相关，药液的渗透压与溶血、肌肉刺激性相关，药液的折光率与其所含的不溶性微粒相关等。

目前国内采用物理化学对热毒宁注射液的质量进行控制的研究不够，甚至缺乏相关的基础研究，仅见少数其他品种的有关零星报道^[5-7]，本文提出了基于物理化学的中药注射液质量标准体系的构建，对热毒宁注射液的8个物理参数（酸碱度、电导率、浊度、折光率、渗透压摩尔浓度、表面张力、相对密度、运动黏度）进行测定，并借由物理指纹谱的方法^[8]，更直观地展现和评价中药注射液质量，为中药注射剂的质量控制提供新的思路。

1 材料

PHS-3C型精密pH计（上海日岛科学仪器有限公司）；DDS-307型电导率仪（上海日岛科学仪器有限公司）；TU-1810型紫外-可见光分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）；A650型全自动折光仪（济南海能仪器股份有限公司）；SMC 30C-1型渗透压摩尔浓度测定仪（天津天河分析仪器有限公司）；DCAT21型表面张力仪（德国Dataphisics公司）；比重瓶（沈阳市华侨玻璃仪器厂）；BSA124S型电子天平（赛多利斯科学仪器有限公司）；0号品氏黏度计（上海中立玻璃仪器有限公司）。

热毒宁注射液（效期内批号160542，160543，160544，160545，160546，160547，160601，160602，160603，160604，160605，160606，160607，160608，160609，160610，160611，160612，160613，160614；效期外批号111201，120201，120701，120801，120802，120803，130201，130501，130801，江苏康缘药业股份有限公司）。

2 方法与结果

2.1 热毒宁注射液物理质量属性确定

根据热毒宁注射液的物理化学性质与质量的相关性，筛选出8个物理参数。

氢离子浓度指数（pH），表示注射液的酸碱度，需控制在一定范围内，是引起防止静脉炎等不良反应的原因之一。

电导率（G），是用来描述物质中电荷流动难易程度的参数，用于控制注射液带电离子浓度及总量。

浊度（t），是指水中悬浮物对光线透过时所发生的阻碍程度，用于控制药液的澄明度。

折光率（N），是光线入射角正弦与折角正弦的比值，用于控制注射液中的不溶性微粒与澄明度等。

渗透压摩尔浓度（O），反映的是溶液中各种溶质对溶液渗透压贡献的总和，用于控制注射液的溶血性和肌肉刺激性。

表面张力（σ），是液体表面任意二相邻部分之间垂直于它们的单位长度分界线相互作用的拉力，用于描述注射液在输液过程中出现的黏壁、油壁等现象，另外还与注射液中溶质混合溶解性、溶质溶解和增溶等有关。

相对密度（d），指在相同的温度、压力条件下，某物质的密度与水密度之比，用于控制药液的纯杂程度。

运动黏度（ν），是流体黏滞性的一种量度，是流体流动力对其内部摩擦现象的一种表示，可从一方面表示注射液的稳定性，也用于描述输液过程中出现的黏壁、油壁等现象。

热毒宁注射液的物理指纹谱由以上8个物理参数构成。

2.2 物理质量指标的测定方法

热毒宁注射液物理指纹谱中参数的测定首选法定标准收载方法。

2.2.1 氢离子浓度指数（pH）^[9] 先依次用标准缓冲溶液（苯二甲酸盐溶液、磷酸盐溶液）标定pH计（26 ℃），再将用纯净水冲洗干净并用滤纸拭干后的复合电极浸入热毒宁注射液中，读取示数。

2.2.2 电导率（G）^[9] 使用电导率的操作旋钮进行校正后，再利用旋钮依次进行温度补偿（26 ℃）和电极常数的设置，最后将铂黑电极浸入热毒宁注射液中，读取示数，再将示数乘以电极常数（1.05），即得电导率。

2.2.3 浊度（t）^[10] 先绘制浊度标准曲线，即分别称取1.000 g硫酸肼和10.00 g六次甲基四胺于2个100 mL量瓶中，用无浊度水溶解、定容，再分别吸取5.0 mL的上述2种溶液于100 mL量瓶中，混匀后静置反应24 h后，用无浊度水定容，此溶液浊度为400 NTU。吸取400 NTU标准浊度溶液0.5，1.25，2.5，5.0，10.0，12.5 mL于6支50 mL具塞比色管中，加无浊度水至标线，摇匀后即得4，10，20，40，80，100 NTU标准浊度溶液，于680 nm波长下测定无浊度水和上述6个标准浊度溶液的吸光度，以浊度为横坐标，吸光度为纵坐标，即得绘制浊度标准曲线。吸取2 mL热毒宁注射液于10 mL量瓶中，用纯净水定容、摇匀，得供试液，在相同条件下测定供试液的吸光度，再由浊度标准曲线方程得到浊度的数值。

2.2.4 折光率（N）^[9] 按仪器说明书操作，在钠光源的D线（589.3 nm）、20.0 ℃的条件下，先使用水进行校正，再将热毒宁注射液装入折光仪中，待测定温度为20.0 ℃时，读取示数，测量后再重复读数2次，取3次读数的平均值即可。

2.2.5 渗透压摩尔浓度（O）^[9] 按仪器说明书操作，首先取适量纯化水调节仪器零点，然后用300，600 mOsmol·kg^-1的标准溶液校正仪器，再取热毒宁注射液测定，平行测定2次，取平均值即可。

2.2.6 表面张力（σ） 按仪器说明书操作，把热毒宁注射液倒入玻璃杯中（26 ℃），将玻璃杯放在托盘的中间位置上，按“上升”键，使铂金环深入到液体中5～7 mm处，按“停止”键停止，然后按“试验”键，托盘和被测液体开始下降，显示值将逐渐增大，当铂金环脱离液面后，按下停止键，则在显示屏的右侧显示当前实测表面张力值。

2.2.7 相对密度（d）^[9] 取洁净、干燥并精密称定质量的比重瓶，装满热毒宁注射液，装上温度计（瓶中应无气泡），置冰水浴中，降温过程中，需补充热毒宁注射液，待温度计显示20 ℃时，用滤纸除去侧管周围的水，立即盖上罩，然后将比重瓶至水浴中取出，再用濾纸将比重瓶的外面擦净，精密测定，减去比重瓶的质量，求得热毒宁注射液的质量后，将其倾去，洗净比重瓶，装满新煮沸的冷水，再照上法测得同一温度时水的质量，热毒宁注射液的质量除以水的质量即为热毒宁注射液的相对密度。

2.2.8 运动黏度（ν）^[9] 取0号品氏黏度计，洗净烘干备用，倒置黏度计，用手指堵住管口2，将管口1插入热毒宁注射液中，用洗耳球自支管F端抽气，使注射液充满球C与A并超过测定线m₂，提出黏度计并迅速倒转，抹去黏附于管外的注射液，用铁架台固定黏度计，使其垂直于冰水浴（20 ℃）中，并使水浴的液面高于球C的中部，放置15 min后，自管口1抽气，使注射液充满球A并超过测定线m₁，开放管口1，使注射液在管内自然下落，用秒表准确记录液面自测定线m₁下降至测定线m₂处的流出时间。不重装试样，依法重复测定3次，另取同批次热毒宁注射液同法操作，以先后2次取样测得的总平均值t带入公式：ν=Kt（K为黏度计常数），即得注射液的运动黏度。

2.3 物理质量指标的标准化转换

由于用于构建物理指纹谱的8个物理参数的数值和量纲不同，为了方便定量直观地利用雷达图进行展示，参考药典标准^[9]和物理化学参数手册^[11]，确定每个指标的可能数值范围，然后将其标准化至同一尺度，即0～10。

2.4 热毒宁注射液物理指纹谱采集及对照物理指纹谱的构建

取效期内的17批热毒宁注射液，按照2.2所确定的方法测定供试品各物理参数，并对数值进行标准化后，得物理指纹叠加图谱，结果见图1，以17批热毒宁注射液各个标准化物理参数的平均值作雷达图，即得对照物理指纹谱。

2.5 限度

2.5.1 相似度^{[12] 将17批热毒宁注射液样品的物理指纹谱与对照指纹谱进行相似度分析，经数据处理软件matlab中夹角余弦法分析计算相似度，均大于0.999。效期内的热毒宁注射液，按照2.2项所确定的方法测定供试品，所得物理指纹谱与对照指纹谱间的相似度应不低于0.999。}

2.5.2 物理参数 17批效期内热毒宁注射液的8个物理参数值及标准化值的范围，见表1。

这17批效期内的热毒宁注射液，按照2.2项所确定的方法测定供试品，所得物理指纹谱，可用于评价其他批次热毒宁注射液的各个指标是否同时满足表1中的标准化范围。

2.6 验证

取12批热毒宁注射液，按照2.2项所确定的方法测定供试品，绘制与对照物理指纹谱的叠加指纹谱，见图2；所得物理指纹谱与对照指纹谱经夹角余弦法（matlab软件）分析计算相似度，相关计算程序自行编写，结果见表2。

可见，以上12批热毒宁注射液样品中，其中在有效期内的3批样品，物理指纹谱相似度和物理参数值均符合限度要求；另外过期的9批样品，物理指纹谱相似度和物理参数值都不符合限度要求。表明，本研究建立的对照指纹图谱可以控制热毒宁注射液的质量。

3 讨论

本研究为了建立基于物理化学的中药注射液质量控制标准和体系，以热毒宁注射液为研究对象，初步探索了其物理化学性质，并借助雷达图来直观展现，研究结果表明，该法可作为评价热毒宁注射液制备工艺可重复性和可控性的工具。

在热毒宁注射液对照指纹图谱验证过程中发现，有9批样品同时都不满足物理指纹谱相似度和标准物理指标要求，为过期样品；另外还有3批样品，其物理指纹谱相似度和标准物理指标均满足要求，为在效期内的样品。验证试验表明本研究建立的物理指纹谱能够对热毒宁注射液的质量进行控制，但由于验证样品批次较少，其准确性有待进一步确认。

另外，从验证结果中还可以发现，pH在效期内和外的热毒宁注射液中变化不明显，9批过期样品中，只有一批样品的pH超出限度，且只超出限度0.30%，而电导率、浊度、折光率、渗透压摩尔浓度、表面张力、相对密度、运动黏度在效期内和外的热毒宁注射液中呈现不同程度的变化，其中折光率判断热毒宁注射液的变化程度达100%，可推测折光率对药品质量影响较大，可能是由于过期的样品不溶性微粒的增多、澄明度降低。可见，物理指纹谱的8个指标能够从一定程度上反映热毒宁注射液的整体质量。

本文用学科交叉的研究技术，构建热毒宁注射液物理指纹谱，可对不同批次间的热毒宁注射液进行质量一致性评价。物理指纹谱包含的参数越多，所表征的质量信息越丰富，通过增加其他物理参数，如油水分配系数^[13-14]、粒度^[15-16]等可提高方法可靠性，但测试时间会延长，降低检测效率，具体应用时，还需结合实验条件、操作简便性等综合考虑，尽量选取对药品质量影响较大的物理参数。另外为后续研究物理化学参数与药物安全性的相关性奠定基础。

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