Ⅱ、Ⅲ期结肠癌患者TS、TP和DPD表达水平与5-Fu为基础的化疗疗效及预后的关系研究

晋国权 李淼

·论著·

Ⅱ、Ⅲ期结肠癌患者TS、TP和DPD表达水平与5-Fu为基础的化疗疗效及预后的关系研究

晋国权 李淼

目的 分析探讨Ⅱ、Ⅲ期结肠癌患者TS、TP、DPD表达水平与5-Fu为基础的化疗疗效及预后的相关性。方法 入选120例术后接受氟尿嘧啶为基础化疗的Ⅱ、Ⅲ期结肠癌患者，采用实时荧光定量PCR(RT-PCR)分析TS、TP、DPD表达水平与化疗疗效及患者生存预后的相关性。结果 肿瘤组织的TP mRNA表达水平明显高于正常组织，DPD mRNA表达水平明显低于正常组织(P<0.01)。经相关性分析，TS与TP、DPD与TP的mRNA相对表达量之间具有弱正相关关系(r2=0.04937,P=0.0096;r2=0.08345,P=0.0007)。TS、TPmRNA的高表达更倾向于对5-Fu化疗药物不敏感，无瘤生存率和总生存率均偏低(P<0.01)；多元COX回归分析结果提示：除了肿瘤分化、肿瘤细胞转移等传统危险因素外，TS、TPmRNA表达也是影响结肠癌总生存率的独立危险因素(OR=2.036,95%CI:1.896～3.656;OR=2.426,95%CI:2.037～2.945)。结论 Ⅱ、Ⅲ期结肠癌患者TS、TP高表达更倾向于对5-Fu化疗药物不敏感且生存预后较差，TS、TP表达情况对临床上制定个体化的化疗方案具有一定的指导价值。

结肠肿瘤；胸苷酸合成酶；胸苷磷酸化酶；二氢嘧啶脱氢酶

近年来，以氟尿嘧啶(5-Fu)为基础的术后辅助化疗方案越来越多的用于恶性肿瘤的辅助化疗。胸苷酸合成酶(TS)、胸苷磷酸化酶(TP)和二氢嘧啶脱氢酶(DPD)是5-Fu代谢和作用途径中的关键酶[1-4]。为了进一步评估上述关键酶在预测Ⅱ、Ⅲ期结肠癌患者接受以5-Fu为基础的辅助化疗方案后治疗效果及生存预后中的临床价值，本研究采用前瞻性观察设计方案，分析探讨Ⅱ、Ⅲ期结肠癌患者TS、TP、DPD mRNA的表达规律，旨在为结肠癌的个体化治疗方案的制定提供依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2007年1月至2009年1月在我院肿瘤科住院治疗的结肠癌患者120例为研究对象。另外，收集同期在我院普外科由于结肠癌之外的疾病而手术切除的正常结肠组织15例为对照。见表1。

表1 120例结肠癌的基本特征及主要临床病理参数

1.2 入选标准 (1)组织病理学检查结果确诊为Ⅱ、Ⅲ期结肠癌；(2)入选患者接受氟尿嘧啶类药物(5-Fu)为基础的辅助化疗方案；(3)临床病历资料记录详实，且理论上能够完成疗效评估及5年随访；(4)知情同意以后，患者及家属同意参加本研究，并签署知情同意书。本研究获得本院医学伦理委员会的审核批准。

1.3 信息采集 采用本研究自制的统一调查表，收集患者的基本信息，包含人口学基本特征及详细的临床病理参数。

1.4 实验室检测

1.4.1 肿瘤组织的收集:入选的研究对象经手术切除肿瘤后，立即收集新鲜的肿瘤组织标本，经0.9%氯化钠溶液冲洗2次浸泡于0.9%氯化钠溶液中；然后用石蜡包埋，经苏木精、伊红染色、中性红染色，最后由病理医生采用显微切割机取10 μm肿瘤组织并确保选中的组织只包含肿瘤组织后，行实时荧光定量PCR实验定量检测TS、TP、DPD mRNA表达。

1.4.2 RNA的提取及RT-PCR实验:切除下的肿瘤组织Trizol法提取RNA，获得每份样本的cDNA后，目标cDNA序列通过实时荧光定量PCR实验进行扩增。RT-PCR的反应体系：600 nmol/L 引物，5 mmol/L MgCl2，200 nmol/L aATP、dCTP、dGTP，400 nmol/L dUTP，总体积25 μl。反应条件：50℃ 10 s；93℃ 10 min；95℃ 15 s 45个循环；95℃ 1 min。本研究所需试剂盒均由北京雅安达生物技术有限公司提供。见表2。

1.5 化疗方案 本组120例患者接受5-Fu+左旋咪唑化疗68例，5-Fu+四氢叶酸化疗方案44例，5-Fu联合紫杉醇8例，化疗剂量均参照说明书的常规剂量。接受化疗后每2个化疗周期行影像学检查进行1次疗效评估。

1.6 疗效评估 参照WHO实体瘤评价标准进行疗效评估，标准[5-8]：完全缓解(CR)：全部可测量肿瘤病灶完全消失持续1个月以上；部分缓解(PR)：肿瘤病灶的最大直径与最大垂直横径乘积总和减少1半以上，持续至少1个月；稳定(SD)：肿瘤病灶最大直径与最大垂直横径乘积总和减少<50%或增大<25%，持续至少1个月且无新病灶出现；疾病进展(PD)：病灶的最大直径与最大垂直横径乘积总和增大>25%，或出现新的病灶。无病生存期指从化疗开始至疾病进展的时间；总生存期指从化疗开始至患者死亡的时间。将CR+PR界定为化疗敏感，SD+PD界定为化疗不敏感。

表2 RT-PCR实验所用的引物序列

1.7 随访 采用门诊随访、电话随访、信件随访等方式对120例结肠癌患者进行随访，末次随访时间2014年12月。

2 结果

2.1 肿瘤组织与正常组织TS、TP、DPD mRNA相对表达水平比较 2组TS mRNA表达水平差异无统计学意义(P>0.05)，肿瘤组织TPmRNA表达水平明显高于正常组织，肿瘤组织DPDmRNA表达水平明显低于正常组织，差异有统计学意义(P<0.01)。见图1。

2.2TS、TP、DPDmRNA相对表达相关性分析 经Pearson相关性分析，TS与TP、DPD与TP的mRNA相对表达量之间具有弱正相关关系，DPD与TS的mRNA相对表达量无相关关系。见表3，图2。

2.3 化疗敏感与不敏感组TS、TP、DPDmRNA相对表达水平比较 化疗不敏感组TS、TPmRNA表达水平均明显高于化疗敏感组，差异均有统计学意义(P<0.05)，2组DPDmRNA表达水平差异无统计学意义(P>0.05)。见表4，图3。

图1 肿瘤组织与正常组织TS、TP、DPD mRNA相对表达水平比较

2.4TS、TPmRNA相对表达水平对患者生存预后的影响 本研究采用电话、信件等不同方式对120例患者进行了≥60个月的随访，平均随访62个月。分别以TS、TPmRNA相对表达水平中位数(TS=1.64;TP=0.27)为界点进行分组，比较2组无瘤生存率及总生存率，经Log-rank检验，TS≥1.64组的无瘤生存率(35%)及总生存率(20%)分别低于TS<1.64组(无瘤生存率：65%；总生存率：45%)，差异具均有统计学意义(P=0.013、P=0.043)。TP≥0.27组的无瘤生存率(39%)及总生存率均(20%)分别低于TP<0.27组(无瘤生存率：67.5%；总生存率：60%)，差异也均具有统计学意义(P=0.022、P=0.0017)。见图4。

图2 肿瘤组织与正常组织TS、TP、DPD mRNA相对表达相关性分析

2.5 结肠癌患者总生存率的COX回归分析 以最后一次随访的结局为因变量，将患者基本特征、临床病理参数、TS、TP、DPDmRNA表达水平为自变量，行多元COX回归分析，肿瘤分化、肿瘤细胞转移、TSmRNA表达、TPmRNA表达为结肠癌总生存率的独立危险因素。见表5。

3 讨论

虽然手术方案仍是结肠癌的代表性治疗手段，但是近期开展的三期临床试验结果表明：以5-Fu为基础的术后辅助化疗方案可以明显改善Ⅲ期结肠癌患者的治疗效果和生存预后，5-Fu也可广泛应用于晚期或转移性疾病的治疗[9-11]。临床实践中，除了建立规范化的临床护理程序外，医学家们积极寻求可以准确识别对标准化治疗方案敏感的恶性肿瘤患者的技术手段，这不仅可以提高治疗效率，还可将治疗效果最优化。这些方法包括评估肿瘤病灶的恶性程度、检测可以引起肿瘤复发的最小残留等。近年来，与化疗药物代谢或药效作用机制相关的关键酶或基因的表达水平检测也越来越多的用于临床实践，并发挥了越来越重要的作用[12-16]。5-Fu可通过三种不同途径被磷酸化作用转化为无活性代谢物。TS、TP和DPD均是上述途径的关键酶。上述关键酶的表达水平在预测结肠癌患者以5-Fu为基础的化疗疗效及预后预测中发挥着重要作用。有研究表明,5-Fu可以抑制TS的分泌，同时上述三种关键酶的调控基因的表达与消化道恶性肿瘤的辅助化疗敏感性相关，可以为肿瘤患者的个体化治疗方案的制定提供参考[16-18]。

图3 化疗敏感与不敏感组TS、TP、DPD mRNA相对表达比较

图4 不同TP、TS mRNA表达水平组生存曲线比较(Log-rank检验)

表3 肿瘤组织与正常组织TS、TP、DPD mRNA相对表达相关性分析

类别TSTPDPD化疗敏感(n=56) 1.03±0.290.32±0.0910.96±7.81化疗不敏感(m=64)2.06±0.400.37±0.2312.98±9.86t值6.2552.2361.549P值0.0060.0460.129

表5 结肠癌患者总生存率的COX回归分析

TS是一种由相同亚基构成的同源二聚体胞浆酶，是体内脱氧核糖核酸(DNA)生物合成所需的胸腺嘧啶核苷酸的起始合成过程的限速酶。若细胞无外源性的胸腺嘧啶供应，这一限速反应是体内胸腺嘧啶脱氧核苷酸(dTMP)的惟一来源。肿瘤细胞在没有外源性的胸腺嘧啶的情况下，TS活性将对肿瘤细胞内胸腺嘧啶的合成起关键作用，可以影响肿瘤细胞的DNA合成、裂解以及凋亡[15,17,19]。TP是影响嘧啶核苷合成、分解的关键酶，目前已证实在许多实体瘤组织中均有表达。TP酶与肿瘤的生长、转移密切相关，还可影响肿瘤细胞对5-Fu为基础的化疗药物的敏感性[3]。DPD是5-Fu分解代谢的起始酶和限速酶，体内80%以上的5-Fu通过DPD不可逆地代谢为无活性的产物。上述研究结论提示：TS、TP、DPD在恶性肿瘤的发生、发展和治疗总起着重要的作用，并影响肿瘤细胞对5-Fu为基础的化疗药物的敏感性[1,3,20]。因此，我们推测采用TS、TP、DPD表达水平预测中晚期结肠癌的化疗效果及预后应该具有重要的价值。

为了证实上述推测，本研究采用前瞻性观察设计，随访术后采用5-Fu为基础的化疗方案的120例Ⅱ、Ⅲ期的结肠癌患者。重点分析TS、TP、DPD表达水平与化疗效果的关系及在预测生存预后中的临床价值。分析结果提示：肿瘤组织的TPmRNA表达水平明显高于正常组织，肿瘤组织的DPDmRNA表达水平明显低于正常组织(P<0.01)。经相关性分析，TS与TP、DPD与TP的mRNA相对表达量之间具有弱正相关关系。另外，TS、TPmRNA的高表达更倾向于对5-Fu化疗药物不敏感，且与中晚期结肠癌较差的预后有关。本研究还对影响结肠癌患者总生存率的影响因素进行了多元COX回归分析，结果提示：除了肿瘤分化、肿瘤细胞转移等传统的恶性肿瘤危险因素外，TSmRNA表达、TPmRNA表达也是影响结肠癌总生存率的独立危险因素。

综上所述，本研究结果显示：Ⅱ、Ⅲ期结肠癌TS、TP高表达患者更倾向于对5-Fu化疗药物不敏感且生存预后较差，TS、TP表达对临床制定个体化的化疗方案具有一定的指导价值，但仍需大样本、多中心、前瞻性的临床研究进一步证实。

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Correlation between the expression levels of TS,TP,DPD and clinical outcome in patients with phase Ⅱ,Ⅲ colon cancer receiving fluorouracil-based chemotherapy

JINGuoquan,LIMiao.

DepartmentofOncologicalSurgery,QinghaiProvincialCancerHospital,Xining810007,China

Objective To investigate the correlation between the expression levels of thymidylate synthase (TS),thymidine phosphorylase (TP), dihydropyrimidine dehydrogenase (DPD) and clinical outcome in patients with phase II,III colon cancer receiving fluorouracil-based chemotherapy.Methods One hundred and twenty patients with phase II,III colon cancer who received postoperative fluorouracil-based chemotherapy were enrolled in the study. Real-time quantitative PCR (RT-PCR) analysis was used to detect the expression levels of TS,TP,DPD.Morever the correlation between the expression levels and therapeutic effects of chemotherapy as well as patient's prognosis was analyzed.Results The expression levels of TP mRNA in tumor tissues were significantly higher than those in normal tissue,however,the expression levels of DPD mRNA in tumor tissues were significantly lower than those in normal tissues (P<0.01).ThecorrelationanalysisshowedthattherewasaweakpositivecorrelationbetweenTSandTPandbetweenDPDandTP(r2=0.04937,P<0.01;r2=0.08345,P<0.01).ThehighexpressionsofTS,TPmRNAweremoreinclinedtobeinsensitiveto5-Fuchemotherapyanddiseasefreesurvivalandoverallsurvivalrateswerelower(P<0.01).ThemultivariateCOXregressionanalysisshowedthatinadditiontotraditionalriskfactorsincludingtumordifferentiationandtumorcellmetastasis,theexpressionsofTSandTPmRNAwerealsoindependentriskfactorsinfluncingcoloncanceroverallsurvivalratea(OR=2.036,95%C.I.:1.896～3.656;OR=2.426,95%C.I.:2.037～2.945).Conclusion The high expressions of TS,TP are more more inclined to be insensitive to 5-Fu chemotherapy,with poor prognosis in patients with phase Ⅱ,Ⅲ colon cancer,thus,the expressions of TS and TP have certain instructive value for instituting individualized chemotherapy scheme in clinical practice.

colon cancer; thymidylate synthase; thymidine phosphorylase; dihydropyrimidine dehydrogenase

10.3969/j.issn.1002-7386.2017.06.001

810007 西宁市，青海省肿瘤医院肿瘤外科(晋国权),肿瘤内科(李淼)

李淼，810007 西宁市，青海省肿瘤医院肿瘤内科；

E-mail：limiao1979@126.com

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A

1002-7386(2017)06-0805-05

2016-07-10)