耐镉细菌不同配施方式对烟叶镉含量及品质的影响

何声宝, 刘 楠，罗安娜，冯晓民,王英元,张 威

(国家烟草质量监督检验中心,河南 郑州 450001)

耐镉细菌不同配施方式对烟叶镉含量及品质的影响

何声宝, 刘 楠，罗安娜，冯晓民,王英元,张 威*

(国家烟草质量监督检验中心,河南 郑州 450001)

为明确从镉污染植烟土壤中筛选得到的耐镉细菌TU菌及其不同配施方式对烟叶镉含量及品质的影响，进一步揭示其对土壤镉污染的修复效果，设置对照(CK)、TU菌(T1)、TU菌+腐殖酸(T2)、TU菌+尿素(T3)、TU菌+磷酸钾(T4)5个处理进行大田试验，比较5个处理烟叶镉含量、外观质量、化学成分及评吸质量的差异。结果表明：与CK比较，T1、T2、T3、T4处理烤后烟叶的镉含量分别降低了32.79%、44.75%、-18.20%、32.46%；不同处理烟叶外观质量表现为T2>T4>T1>CK>T3；化学成分以T2和T1处理最为协调，T3处理最差；评吸质量得分表现为T2>T4>T1>CK>T3。因此，生产过程中施用TU菌对烟叶有降镉提质作用，腐殖酸对TU菌降低烟叶镉含量和提高烟叶质量的功效具有加成作用。

耐镉细菌； 烟叶； 镉含量； 品质

随着吸烟与健康课题的深入探讨，重金属研究逐渐成为烟草减害的热点之一。镉具有毒性大、易积累、在烟气中迁移比例高等特点[1-2]，是烟草控制框架公约(FCTC)优先披露的有害成分之一。烟叶中的镉主要来源于土壤[3]，在烟株生长过程中经根部吸收最终富集在烟叶中。有研究表明，镉污染导致烤烟烟叶化学成分不协调，不利于烟叶吃味的形成，大大降低烟草品质[4]。

随着人类对镉危害意识的增强，对植烟土壤中镉修复方法的研究更为广泛。目前，土壤镉修复方法主要有物理法、化学法和生物法等。物理方法是指利用物理机械治理重金属污染土壤[5]，但该方法能耗大、修复周期长。化学方法是指利用酸/螯合剂等达到修复的目的，但对土壤破坏严重，存在二次污染[6-8]。有研究表明,腐殖酸、磷酸钾、尿素均对镉有一定的钝化功能[9-11]，但是前人研究仅处于实验室阶段，并未结合生产实际进行大田试验。生物修复方法是指利用一些微生物，通过胞外络合[12-15]、胞外沉淀[16]、胞内积累[17]等方式，降低重金属在土壤中的有效浓度，达到修复的目的[18]，该方法不存在二次污染，具有对土壤破坏性小、修复周期短等特点，近年来得到广泛关注。Lebeau等[19]研究发现，细菌ZAN-044在一定条件下对镉的吸附率为69%；刘红娟等[20]研究显示，蜡样芽胞杆菌通过细胞内外的沉积作用来降低土壤中镉的有效含量；毕娜等[21]筛选出2株对镉具有吸附能力的革兰氏阴性细菌。目前该类技术也只是处于实验室研究阶段，并未进行大田试验验证，而且针对植烟土壤镉的生物修复方法还未见报道。鉴于此，基于在前期试验中从镉污染的植烟土壤中筛选出1株特定耐镉细菌TU菌的基础上，将TU菌分别与腐殖酸、尿素、磷酸钾配施进行大田试验，比较了不同处理对烟草各生育时期镉含量、烟叶外观质量、化学成分及评吸质量的差异，旨在揭示TU菌及其不同配施方式在烟草生产过程中对植烟土壤的生物修复效果，为有效控制烟叶中镉含量提供依据。

1 材料和方法

1.1 试验地概况及供试材料

试验地为百色市烟草公司试验田，多年用于烟草重金属相关试验研究，共3 400 m2。供试土壤基本理化性状[22]：全氮3.22 g/kg、有机质43.70 g/kg、有效钾16.00 mg/kg、速效钾98.00 mg/kg，土壤 pH值为8.02；镉含量达到3.62 mg/kg，远高于Ⅲ级土壤标准[23]，属于重金属镉中重度污染土壤。

供试烟草品种为云烟97。TU菌的来源：选取镉污染植烟土壤，由清华大学研究人员通过液相富集法进行分离、筛选、优化、培养后，得到1株耐镉、耐盐的突变细菌菌株，该菌株由北京协和医院提取其DNA用于菌种鉴定，菌株16S rDNA 序列与阴沟肠杆菌(Enterobactercloacae)的16S rDNA序列同源性为100%，故该菌株为阴沟肠杆菌，命名为TU。结合标准方法[24-25]鉴定其生理生化特性，通过镉胁迫试验发现，TU菌分泌的细胞外多糖能够与可交换态镉络合，降低镉的活性。腐殖酸(原粉，有机质含量≥95%)由山西亿丰腐植酸厂生产。尿素(总氮≥46.4%)由山东瑞星化工有限公司提供。磷酸钾(分析纯)购自南京化学试剂股份有限公司。

1.2 试验设计

试验共设对照(CK，即不做任何处理，同当地正常生产方法)、TU菌(T1)、TU菌+腐殖酸(T2)、TU菌+尿素(T3)、TU菌+磷酸钾(T4)5种处理。根据预试验结果：随着TU菌剂(光密度OD600值为75)加入量的增加，土壤交换态镉含量呈下降趋势，当1 m2土壤中(深度为30 cm)加入菌剂10 mL以后，土壤交换态镉含量趋于稳定，故选择100 L/hm2作为TU菌(光密度OD600值为75)的用量；同样，结合文献[9-11]进行预试验，结果表明，当1 m2土壤中(深度为30 cm)施用腐殖酸、尿素、磷酸钾用量分别在75.0、37.5、75.0 g/m2时，土壤中镉含量最低，故本试验选取750、375、750 kg/hm2分别作为腐殖酸、尿素、磷酸钾的大田试验用量。

各处理中的TU菌、腐殖酸、尿素、磷酸钾均在烟苗移栽前24 h均匀施入土壤表层，随后翻耕混匀。每个试验处理小区面积为667 m2左右。4种处理和CK的田间施肥(基肥、追肥)水平及管理完全一致，参照百色市2015年特色优质烟叶生产技术方案执行。

1.3 方法

1.3.1 取样 烟苗移栽后，依据实际生长情况分别在苗期、伸根期、旺长期、成熟初期、成熟采收期取烟叶样品。每次取样每个处理分10个点各取1株(第1次每个点取3株，确保检测量)，要求10个点均匀分布在处理小区内(每个点都进行GPS定位)。对所取烟叶用去离子水洗净，烘干，粉碎，过0.15 mm筛，用于测定重金属镉含量。烟叶成熟采收后，统一烘烤。每个处理取C3F烟叶样品3 kg进行镉含量、外观质量、化学成分、评吸质量检测与分析，重复3次取样。

1.3.2 镉含量测定 按照YC/T 380—2010[26]进行重金属镉含量的测定，所用仪器为电感耦合等离子体质谱仪。

1.3.3 外观质量评价 根据中国烟叶质量白皮书[27]中烟叶外观质量的评价标准对烘干后烟叶样品进行外观质量评价，评价工作在国家烟草质量监督检验中心标准分级实验室进行，由烟叶等级检验委员会委员进行评价。

1.3.4 化学成分含量测定 烟叶中总糖(TS)、还原糖(RS)、烟碱(Nic)、氯(Cl)、总氮含量参照YC/T 159～162—2002[28-31]测定，钾(K)含量参照YC/T 217—2007[32]测定。所用仪器为AA3型连续流动分析仪(英国 SEAL公司)。

1.3.5 感官评吸 取各处理烟叶样品，放入恒温恒湿实验室回潮至含水率18.0%～21.0%，去梗、切丝(宽度0.8 mm)。然后在GB/T 16447—2004[33]规定的条件下调节温湿度，使烟丝含水率达到12.5%左右，制成卷烟。由国家烟草质量监督检验中心评吸委员会委员进行感官评吸，评吸依据九分制打分。

1.4 数据处理

采用 Excel 2010和DPS 7.05软件进行数据统计分析。

2 结果与分析

2.1 不同处理烟株各生育时期烟叶的镉含量

图1所示，苗期，烟叶镉含量表现为T1、T2处理低于CK，T3、T4处理稍高于CK，烟苗移栽后，还苗成活还需一段时间，各处理的作用效果还未完全体现在烟叶镉含量上；伸根期，烟叶镉含量以T2处理最低，其次为T4、T1处理，均明显低于CK，而T3处理明显高于CK，各处理与CK差异最大；旺长期、成熟初期、成熟采收期，除T3处理外，其他处理烟叶镉含量均低于CK。

图1 不同处理烟株各生育时期烟叶镉含量的差异分析

2.2 不同处理烤后烟叶的镉含量

由表1可见，与CK相比，T1、T2、T3、T4处理烟叶镉含量分别降低32.79%、44.75%、-18.20%、32.46%。除T3处理高于CK外，其他处理烤后烟叶镉含量均显著低于CK，尤以T2处理最低。T1处理为TU菌剂单一处理，烟叶镉含量为4.10 mg/kg，显著低于对照(6.10 mg/kg)，分析原因可能是,TU菌分泌的细胞外多糖(前期预试验发现)能与土壤中可交换态镉络合，降低隔的活性，间接减少了烟株对隔的吸收；T2处理烟叶镉含量最低，只有3.37 mg/kg，腐殖酸作为生物有机物质，本身对重金属有一定钝化作用[34]；T4处理效果与T1处理相当，说明化学试剂磷酸钾对TU菌钝化土壤镉的效果影响较小；钝化效果最差的为T3处理，其烟叶中镉含量高于CK，且显著高于其他3个处理，这可能与尿素能提高土壤中交换态镉含量[35]，进而促进作物对镉的吸收有关。不同处理烤后烟叶镉含量的变异系数以T2处理最高，但小于15%，说明所有测定数据不存在异常，均能准确反映烟叶实际镉含量。

表1 不同处理烤后烟叶镉含量差异分析

注：同列不同小写字母表示在0.05水平差异显著，下同。

2.3 不同处理烤后烟叶的外观质量

由表2可见，颜色得分以T4处理最高，其次为T1、T2处理，三者均高于CK且显著高于T3处理；成熟度得分以T2处理最高，其次为T4处理，二者均高于CK，但差异不显著，T1处理与CK相当且显著高于T3处理；在叶片结构、身份、油分、色度得分上均以T2处理最高，T3处理最低，其中T3处理的色度得分显著低于T2、T4处理，其余指标各处理间均无显著差异；各处理烤后烟叶外观质量总分表现为T2>T4>T1>CK>T3，其中T2、T4处理显著高于T3处理。

表2 不同处理烤后烟叶的外观质量 分

2.4 不同处理烤后烟叶的化学成分

由表3可见，烟碱含量以T3处理最高，且显著高于T1处理，T1、T2处理均低于CK，但无显著差异；总糖含量T2处理最高，其次为T1、T4处理，三者均显著高于CK，T3处理则显著低于CK和其他处理；还原糖含量表现为T1、T2、T4处理高于CK，但差异不显著，T3处理显著低于CK和其他处理；氯含量以T2处理显著高于其他处理，T3处理最低，但与CK无显著差异；钾含量以T3处理显著高于其他处理和CK，其他处理间无显著差异；总氮含量各处理与CK均无显著差异，但T3处理显著高于T1、T2、T4处理。

表3 不同处理烤后烟叶的常规化学成分 %

2.5 不同处理烤后烟叶的评吸质量

由表4可以看出，T1、T2、T4处理在香气质、杂气、刺激性、余味得分和总分上均高于CK，尤其是香气质得分显著高于CK，而浓度和劲头得分低于CK，但差异均不显著；除浓度、劲头、灰分外，T3处理评吸质量各指标得分均最低，香气质、余味得分和总分均显著低于CK和其他处理。各处理总体评吸质量表现为T2>T4>T1>CK>T3。

表4 不同处理烤后烟叶的评吸质量 分

3 结论与讨论

本研究结果表明，与CK比较，T1、T2、T3、T4处理烤后烟叶的镉含量分别降低32.79%、44.75%、-18.20%、32.46%，即各处理对土壤镉的最终钝化效果为T2>T1>T4>CK>T3；烟叶外观质量为T2>T4>T1>CK>T3；化学成分以T2和T1处理最协调，T3处理最差；评吸质量得分表现为T2>T4>T1>CK>T3。

本研究选用的TU菌在有效降低烟叶镉含量的同时，能提高烤后烟叶整体质量，适合用于镉污染较轻的植烟土壤。单独施用TU菌的钝化效果在烟株伸根期表现较明显，后期随根系生长降低，生产上可考虑通过提前施用TU菌以及增加TU菌在土壤中施用深度等措施来改善最终的钝化效果。腐殖酸对TU菌在降低烟叶镉含量和提高烟叶质量方面均有加成作用，腐殖酸作为生物有机物质，不仅自身对重金属有一定的钝化作用，还能进一步改良土壤性状，具有使肥料增效、刺激作物生长的功能[34]，生产上针对镉污染偏重的植烟土壤，应在施用TU菌的基础上配施腐殖酸。磷酸钾虽对烟叶质量有一定改善，但对TU菌钝化镉的作用效果不明显，结合生产成本考虑不推荐磷酸钾与TU菌配施方法；尿素对TU菌钝化镉污染的效果有抑制作用，烟叶镉含量显著提高，烟叶质量明显下降，这可能与尿素能促进作物对镉的吸收，易造成烟叶贪青晚熟[35]有关。前人在实验室内的研究表明，尿素对土壤有一定的降镉作用[11]，但这并不能准确反映在大田试验中，栽培上应以大田试验效果为主。另外，本研究因前期破坏性取样量较大，缺乏对烟叶产量的分析，下一步将补充完成相关试验分析，综合考察TU菌对烟叶的作用效果。

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Effects of Different Combined Application Modes of Cadmium-Resistant Bacteria on Cd content and Quality of Tobacco Leaves

HE Shengbao,LIU Nan,LUO Anna,FENG Xiaomin,WANG Yingyuan,ZHANG Wei*

(National Tobacco Quality Supervision and Test Center,Zhengzhou 450001,China)

In order to clear the effects of TU and its different combined application modes on Cd content and quality of tobacco leaves,to further reveal its remediation effect，we set up the treatments:control(CK),TU(T1),TU+humic acid(T2),TU+urea(T3),TU+potassium phosphate(T4) to conduct the field experiment.The differences of Cd content of tobacco,tobacco appearance quality,chemical composition and smoking quality among 5 kinds of Cd application mode were studied.The results showed that compared with CK,Cd contents of tobacco leaves in T1,T2,T3,T4 treatments were decreased by 32.79%,44.75%,-18.20%,32.46% respectively；the order of appearance quality of the tobacco leaf was T2 >T4>T1>CK>T3；chemical composition in T2 and T1 treatments were the most harmonious,T3 treatment was the worst；the order of smoking quality of the tobacco leaf was T2>T4>T1>CK>T3.So applying TU during production could reduce the Cd content and improve the quality of tobacco leaf.Humic acid could enhance the efficacy of TU.

cadmium-resistant bacteria; tobacco leaf; cadmium content; quality

2016-09-07

广西区烟草公司科技项目(532014D16)

何声宝(1984-)，男，安徽霍山人，工程师，硕士，主要从事烟叶外观质量评价及常规化学检验工作。 E-mail:272234895@qq.com

*通讯作者：张 威(1974-)，男，河南郑州人，高级工程师，硕士，主要从事烟草化学检测工作。 E-mail:zhangw_jh@163.com

S182;S572

A

1004-3268(2017)03-0047-05