烟草青枯病病圃土壤细菌组成的高通量测序分析

曹 毅，陆 宁，陈兴江，孟建玉，商胜华

(贵州省烟草科学研究院，贵州 贵阳 550081)

烟草青枯病病圃土壤细菌组成的高通量测序分析

曹 毅，陆 宁，陈兴江，孟建玉，商胜华

(贵州省烟草科学研究院，贵州 贵阳 550081)

为了解烟草青枯病与土壤细菌群落结构的关系，采用454焦磷酸测序技术对烟草青枯病抗性鉴定圃中的土壤细菌组成进行了分析。结果表明，从病圃土壤中获得了1 963条高质量序列，归属于14个已知细菌门类、尚未培养出的细菌和分类地位未知的种类，其中变形菌门、绿弯菌门、酸杆菌门、浮霉菌门、放线菌门、芽单胞菌门为病圃土壤中的优势菌群，分别占总菌群数的29.91%、17.10%、13.73%、11.46%、7.08%、6.40%。烟草青枯病病圃土壤中的拟杆菌门和放线菌门细菌在总菌群中丰度较低，可能与烟草青枯病发生存在关联。

烟草； 青枯病； 土壤； 细菌群落； 高通量测序

烟草青枯病是由茄科雷尔氏菌(Ralstoniasolanacearum)引起的一种细菌性土传病害，具有广泛的寄主，可以侵染50多个科的200多种植物，其中烟草、马铃薯、番茄等茄科作物受害最为严重[1]。从1880年在美国北卡罗来纳州首次被发现至今已有130余年的历史，如今烟草青枯病几乎分布于世界上所有烤烟种植区，其中热带和亚热带烟区发病尤为严重，该病是威胁世界烟草生产的一大毁灭性病害[2]。目前，利用化学防治、合理轮作、抗病品种、植物抗性诱导、土壤改良修复及综合防控等措施防治作物青枯病均未能有效控制病害的发生[3-6]。发展对人畜安全、环境友好的生物防治备受重视。近年来，国内外利用无致病力青枯菌菌株[7]、根际微生物[8]、植物内生菌[9]、噬菌体[10]防治青枯病取得了一些进展，现有生物防治实践在实验室或温室内取得了一定的控病效果，但在大田生产上却鲜有成功报道，土壤中土著微生物的竞争和复杂土壤理化特性等生态因子协同作用下的土壤抑菌作用，是影响生防微生物在土壤中萌发、定殖、种群构建进而发挥生防作用的关键因子[11]。

研究发现，土传病害的发生是由于土壤中数量巨大的微生物间的生态位竞争使得种群结构失衡而导致[12]。现有对土壤微生物的种类、多样性及功能的认识几乎都是基于实验室纯培养方法进行，然而通过培养方法估计的土壤微生物种类不到总量的1%[13]，对微生物群落整体构成特征及功能的认识更远远落后于对其个体的认识。随着现代分子生物学技术的发展和完善，特别是近年来不断发展的基于高通量测序的宏基因组学技术，在理论上覆盖了样品中的全部微生物，为揭示特定复杂生态系统的本质提供了新策略。因此，利用高通量测序技术研究青枯病病土中的微生物组成和多样性，对于认识病害发生及实现生物防治具有重要意义。位于贵州省黔南州福泉市贵州省烟草科学研究院的的烟草青枯病抗病鉴定圃自1986年作为烟草品种抗病鉴定病圃使用，1997年国家烟草专卖局指定其作为全国烟草品种抗病鉴定病圃，到目前为止已进行了3 000余份品种资源的抗性鉴定[14]，病圃年度间发病均匀且常年未使用化学药剂和其他防治措施，是自然条件下进行烟草青枯病病土微生物研究的优良材料。因此，对该病圃土壤细菌种群进行高通量测序分析，旨在为深入掌握大田病土中的细菌组成、多样性进而调控土壤微生物区系、控制土传病害奠定基础。

1 材料和方法

1.1 材料

土壤取自贵州省烟草科学研究院福泉烟草青枯病病圃。田间5点取样，去除表土后，用灭菌铲采取10～25 cm深的土壤样品，充分混匀后分别用5 mm、2 mm灭菌土筛去除植物残根、大块土壤，过筛土壤装入无菌封口袋，通过冰袋冷藏运送至实验室进行土壤总DNA制备。

土壤总DNA提取试剂盒Power Soil®DNA Isolation Kit购自MOBIO公司(MoBio Laboratories，Carlsbad，CA，USA)，Qubit®2.0 dsDNA定量分析试剂盒购自英潍捷基(上海)贸易有限公司，扩增和测序用的试剂及耗材购自罗氏诊断产品(上海)有限公司。16S rDNA Amplicon 454高通量测序由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 土壤总DNA提取 称取10 g土壤，于灭菌研钵中加入液氮研磨样品，称取250 mg研磨后的土壤(3个平行)，参照说明书的方法，在提取前进行65 ℃水浴处理10 min，并用样品研磨仪(Retsch MM400)进行20 Hz、2 min振荡，以利于土壤内微生物的充分破碎。其余步骤参照说明书方法进行，提取后通过琼脂糖凝胶电泳和Qubit 2.0定量平台检测提取的总DNA质量和浓度，-80 ℃冰箱保存备用。

1.2.2 高通量测序 采用细菌16S rDNA V1—V3区通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′)和518R(5′-ATTACCGCGGCTGCTGG-3′)扩增目的片段。引物融合454接头序列(Prime A：CGTATCGCCTCCCTCGCGCCATCAG，Prime B：CTATGCGCCTTGCCAGCCCGCTCAG)、Key碱基(TCAG)和标签序列(Barcode：CGTACGC)，本试验所用融合引物如下：正向融合引物=Prime A+Key碱基+Barcode+27F，反向融合引物=Prime B+518R。

PCR扩增采用50 μL反应体系进行，包括1×PCR buffer，0.2 μmol/L正、反向融合引物，0.2 mmol/L dNTPs，10 ng基因组DNA，2.5 U PlantiumTaq，灭菌水补足50 μL。采用降落(touch down)PCR扩增目的片段：94 ℃预变性2 min；94 ℃ 30 s，45 ℃ 20 s，65 ℃ 60 s(5个循环)；94 ℃ 30 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s(20个循环)；72 ℃最后延伸8 min。PCR反应重复3次，扩增产物采用1.5%的琼脂糖凝胶进行电泳检测，参照胶回收试剂盒(MinElute® Gel Extraction Kit，Qiagen)说明书方法回收扩增产物，采用Qubit 2.0定量平台进行浓度测定，产物送交生工生物工程(上海)股份有限公司利用罗氏454 GS FLX Titanium平台进行测序。

1.2.3 测序数据处理 数据处理和分析主要采用Mothur[15]软件进行，根据Barcode序列区分样品，获取有效序列，采用PyroNoise算法[16]去除测序时的噪音、低质量序列；去除序列末端的后引物和接头序列、多碱基N、polyA/T尾巴、低质量碱基及Barcode标签和前引物序列；丢弃测序长度短于200 bp、模糊碱基数大于0、序列平均质量低于25的序列，统计优化序列数据和长度分布。运用UCHIME[17]软件去除嵌合体，最远邻接法聚类生成可操作分类单元(operational taxonomic unit，OTU)。将代表性序列与Greengene分类数据库中的参考序列进行比对，赋予各OTU分类地位[18]。

2 结果与分析

2.1 测序数据的质量控制

测序后，样本共获得3 613条序列(图1A)，原始测序数据长度主要集中在400～600 bp，少部分序列分布于100～300 bp。根据细菌16S rDNA V1—V3区长度及454测序特点，去除了长度200 bp以下、模糊碱基数大于0、序列平均质量低于25的序列，共获得3 334条初步优化序列(图1B)。

A.原始测序序列长度及分布统计;B.优化序列长度及分布统计

2.2 测序数据的处理

提取非重复序列(3 069条)与Greengene数据库比对，加入gap对齐，“掐头去尾”将所有序列长度截齐，并去除噪音序列，获得2 079条序列；去除92条嵌合体序列(约占总序列数的4.4%)，将余下序列与Greengene注释数据库比对，去除匹配不上的杂序列如植物线粒体、叶绿体序列，最终获得1 963条高质量序列用于后续分析。

2.3 基于OTU的菌群丰富度和多样性

就细菌16S rDNA序列而言，按相似性水平可得到不同OTU，一般认为，相似性97%(0.03)可以定义为种水平，相似性95%(0.05)可以定义为属水平。本研究将序列相似性在97%水平的序列合并为一个分类单元，1 963条序列共获得1 081个OTU。从样本中抽取一定数量的个体，统计个体所代表的物种数目，分别以个体数和物种数构建稀释性曲线。从本研究数据构建的稀释性曲线(图2)来看，在测序量增加的初始阶段，OTU数量呈急剧上升趋势，随测序量的不断增加，OTU数量的增加基本趋向于平缓，但仍有上升趋势，表明本次取样基本合理，可以初步反映土壤中细菌种群构成，但尚有部分微生物未被发现。

图2 病圃土壤样品的稀释性曲线

2.4 基于分类地位的菌群组成分析

将OTU中每一条优质序列与Greengene分类数据库进行比对，找出其最相近且可信度(threshold)达80%以上的种属信息后，将每一个OTU中的所有序列进行类比，找出同一OTU中不同序列的最近祖先种属信息，在保留最可能多信息量的情况下，确保得出信息的准确性。从门水平上的分类结果来看(图3)，病圃土壤中细菌共有14个已知细菌门：变形菌门(Proteobacteria)、绿弯菌门(Chloroflexi)、酸杆菌门(Acidobacteria)、浮霉菌门(Planctomycetes)、放线菌门(Actinobacteria)、芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)、装甲菌门(Armatimonadetes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、蓝藻门(Cyanobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)、硝化螺旋菌门(Nitrospirae)、绿菌门(Chlorobi)、疣微菌门(Verrucomicrobia)、迷踪菌门(Elusimicrobia)；其余为尚未获得培养的细菌(Candidate division TM7、TM6、WS3、OD1、FBP、BRC1)及分类地位未知的种类(unclassified bacteria)。从组成比例来看，变形菌门、绿弯菌门、酸杆菌门、浮霉菌门、放线菌门、芽单胞菌门为土壤中的优势菌群，分别占总菌群数的29.91%、17.10%、13.73%、11.46%、7.08%、6.40%。

图3 门分类水平下的细菌组成

3 结论与讨论

土壤环境中存在大量未知或不可培养的微生物，利用传统分子生物学技术如变性/温度/时间温度梯度凝胶电泳(denatured/temperature/temporal temperature gradient gel electrophoresis，DGGE/TGGE/TTGE)、末端限制性片段长度多样性(terminal restriction fragment length polymorphism，T-RFLP)、单链构象多态性(single-strand conformation polymorphism，SSCP)、荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization，FISH)、Southern印记、定量PCR、基因芯片等研究微生物多样性已广泛应用于环境微生物中[19]，基于细菌16S rDNA的454焦磷酸高通量测序技术由于可直接研究环境中的总DNA，通量、灵敏度高，无需克隆建库而直接测序，避免了传统研究手段的技术繁琐、通量及灵敏度低、定量困难等局限，为研究微生物群组成和多样性开辟了新技术平台[20]。本研究利用454测序技术分析了典型自然条件下烟草青枯病病土细菌的组成和多样性，通过测序数据处理和分析，获得1 963条优化序列，从稀释性曲线结果来看，曲线还有上升趋势，表明本次采取的样品中还有未探测到的细菌。一方面，可能由于454多样品测序时样本所分配得到的序列数偏少；另一方面，本研究是对细菌16S rDNA的V1—V3区进行测序，如果对16S rDNA其他可变区进行测序可能获得更好的结果。分类学分析表明，烟草青枯病病圃土壤中细菌由14个已知细菌门类、尚未培养出的细菌和分类地位未知的种类组成，其中变形菌门、绿弯菌门、酸杆菌门、浮霉菌门、放线菌门、芽单胞菌门为病圃土壤中的优势菌群。在现有农田土壤细菌多样性研究中，无论作物类型、土壤理化性质、生态因子、地理位置等存在何种差异，拟杆菌门细菌均被认为是农田土壤生态系统中的优势菌群[21-23]，而本研究的结果表明，该门细菌仅占病圃土壤细菌的1.5%，这一菌群在病圃土壤微生物系统中显著不平衡，可能与烟草青枯病发生存在密切联系，该类群细菌与烟草青枯病的互作关系值得进一步深入研究。此外，对青枯病及其他植物病害具有较好生防作用的放线菌门细菌[24]在病圃土壤中虽然为优势菌群之一，但并不占主导地位，这一菌群在烟田土壤中的低丰度存在可能也与病圃青枯病的严重发生相关。拟杆菌门和放线菌门在土壤细菌中组成比例的降低或许能作为大田烟草青枯病易发的指标。

本研究对烟草青枯病病田土壤细菌种群的组成和多样性有了更为全面的认识，未来可进一步对细菌种群结构的时空变化规律、细菌种群及其他微生物(真菌、古菌、病毒等)与青枯病的相互关系等方面进行深入研究，为有针对性地筛选青枯病高效生防资源、联合使用多种生防因子、发展植烟土壤有益微生物区系调控技术，进而有效控制青枯病提供新的线索。

[1] Hayward A C.Biology and epidemiology of bacterial caused byPseudomonassolanacearum[J].Annual Review of Phytopathology,1991,29：65-87.

[2] 朱贤朝,王彦亭,王智发.中国烟草病害[M].北京：中国农业出版社,2002：152-162.

[3] 郭坚华,孙平华,吴云波.植物细菌性青枯病的生物防治机制和途径[J].中国生物防治,1997,13(1)：42-46.

[4] Dalal N R,Dalal S R,Golliwar V G,etal.Studies on grading and pre-packaging of some bacterial wilt resistant brinjal(SolanummelongenaL.) varieties[J].Journal of Soils and Crops,1999,9(2)：223-226.

[5] Vincent V M,Mew T W.Effect of a soil amendment on the survival ofRalstoniasolanacearumindifferent soils[J].Phytopathology,1998,88(4)：300-305.

[6] 纪成灿,方树民,顾钢.烟草品种抗青枯病鉴定中的相关因素分析[J].中国烟草科学,2000,21(2)：1-4.

[7] Dong C,Zeng X M,Liu Q Q.Biological control of tomato bacterial wilt with avirulent bacteriocinogenic strain ofRalstoniasolanacearum[J].Journal of South China Agricultural University,1999,20(4)：1-4.

[8] Lwin M,Ranamukhaarachchi S L.Development of biological control ofRalstoniasolanacearumthrough antagonistic microbial populations[J].International Journal of Agriculture & Biology,2006,8(5)：657-660.

[9] Tan H M,Cao L X,He Z F,etal.Isolation of endophytic actinomycetes from different cultivars of tomato and their activities againstRalstoniasolanacearuminvitro[J].World Journal of Microbiology and Biotechnology,2006,22(12)：1275-1280.

[10] Fujiwara A,Fujisawa M,Hamasaki R,etal.Biocontrol ofRalstoniasolanacearumby treatment with lytic bacteriophages[J].Applied and Environmental Microbiology,2011,77(12)：4155-4162.

[11] de Boer W,Verheggen P,Klein Gunnewiek P J A,etal.Microbial community composition affects soil fungistasis[J].Applied and Environmental Microbiology,2003,69(2)：835-844.

[12] Hoitink A J,Fahy P C.Basis for the control of soilborne plant pathogens with composts[J].Annual Review of Phytopathology,2003,24(1):93-114.

[13] Kellenberger E.Exploring the unknown：The silent revolution of microbiology[J].EMBO Reports,2001,2(1)：5-7.

[14] Cao Y,Tian B Y,Liu Y X,etal.Genome sequencing ofRalstoniasolanacearumFQY_4, isolated from a bacterial wilt nursery used for breeding crop resistance[J].Genome Announcements,2013,1：e00125-13.

[15] Schloss P D,Gevers D,Westcott S L.Reducing the effects of PCR amplification and sequencing artifacts on 16S rRNA-based studies[J].PLoS One,2011,6(12)：e27310.

[16] Quince C,Lanzén A,Curtis T P,etal.Accurate determination of microbial diversity from 454 pyrosequencing data[J].Nature Methods,2009,6(9)：639-641.

[17] Edgar R C,Haas B J,Clemente J C,etal.UCHIME improves sensitivity and speed of chimera detection[J].Bioinformatics,2011,27(16)：2194-2200.

[18] McDonald D,Price M N,Goodrich J,etal.An improved Greengenes taxonomy with explicit ranks for ecological and evolutionary analyses of bacteria and archaea[J].The ISME Journal,2012,6(3)：610-618.

[19] Kirk J L,Beaudette L A,Hart M,etal.Methods of studying soil microbial diversity[J].Journal of Microbiological Methods,2004,58(2)：169-188.

[20] Schloss P D,Handelsman J.Status of the microbial census[J].Microbiology and Molecular Biology Reviews,2004,68(4)：686-691.

[21] Lauber C L,Hamady M,Knight R,etal.Pyrosequencing-based assessment of soil pH as a predictor of soil bacterial community structure at the continental scale[J].Applied and Environmental Microbiology,2009,75(15)：5111-5120.

[22] Liu J J,Sui Y Y,Yu Z H,etal.High throughput sequencing analysis of biogeographical distribution of bacterial communities in the black soils of northeast China[J].Soil Biology and Biochemistry,2014,70(2)：113-122.

[23] 刘玮琦,茆振川,杨宇红,等.保护地根结线虫发生地土壤微生物群落多样性的研究[J].中国生物防治,2008,24(4)：318-324.

[24] Palaniyandi S A,Yang S H,Zhang L,etal.Effects of actinobacteria on plant disease suppression and growth promotion[J].Applied Microbiology and Biotechnology,2013,97(22)：9621-9636.

Pyrosequencing Analysis of Soil Bacteria Composition in Tobacco Bacterial Wilt Disease Nursery

CAO Yi，LU Ning，CHEN Xingjiang，MENG Jianyu，SHANG Shenghua

(Guizhou Academy of Tobacco Science，Guiyang 550081，China)

In order to understand the relationship between soil bacterial community structure and tobacco bacterial wilt disease,the soil bacterial composition and diversity in tobacco bacterial wilt disease nursery were investigated by 454 pyrosequencing.The results indicated that a total of 1 963 effective reads were obtained from soil sample,which belonged to 14 phyla of bacteria,uncultured bacteria and unclassified bacteria.Proteobacteria,Acidobacteria,Chloroflexi,Acidobacteria,Planctomycetes,Actinobacteria and Gemmatimonadetes were dominant taxa,accounting for 29.91%,17.10%,13.73%,11.46%,7.08%,6.40% of the total bacterial groups in the soil,respectively.The lower abundance of Bacteroidetes and Actinobacteria might be associated with the occurrence of tobacco bacterial wilt disease.

tobacco； bacterial wilt disease； soil； bacteria flora； pyrosequence

2016-07-28

中国烟草总公司贵州省公司科技计划项目(201603)

曹 毅(1982-)，男，云南会泽人，副研究员，博士，主要从事烟草植物保护和生物防治工作。 E-mail：yicao1001@163.com

S435.72

A

1004-3268(2017)03-0081-05