增强氯化血红素催化活性用于水胺硫磷比色检测研究

陈华云 吴远根 杨文平 赵静

摘要建立了一种基于增强氯化血红素（Hemin）过氧化物酶催化活性比色检测水胺硫磷的方法。在H2O2存在下，Hemin催化氧化底物3，3′，5，5′四甲基联苯胺（TMB），使其失去1个电子，导致反应体系由无色变为蓝绿色。水胺硫磷的加入可提高Hemin对底物亲和力，进一步增强其催化活性，使底物氧化失去2个电子，反应体系由蓝绿色变为黄色，且颜色变化程度与水胺硫磷浓度成正比。在最优条件下，本方法的动态检测范围为2～100μg/L，检出限为1.2μg/L（3σ）。其它有机磷农药对水胺硫磷检测无明显干扰，实际样品中水胺硫磷的加标回收率为93.0%～113.0%。本方法可应用于农产品中水胺硫磷残留的检测。

关键词氯化血红素；水胺硫磷；过氧化物酶；有机磷农药

1引言

水胺硫磷作为一种高毒有机磷农药，在蔬菜种植等方面仍被经常非法使用，引发一系列安全问题[1]。目前，有机磷农药检测的方法有色谱法[2]，酶抑制法[3]，免疫学[4，5]方法等。色谱法分析时间长且需要昂贵仪器和专业操作人员；酶抑制法等灵敏度相对较差，且易产生假阳/阴性现象。近年来，荧光法[6，7]、纳米材料如纳米金[8]、二氧化铈[9]、磁性四氧化三铁[10]、氧化石墨烯[11]、分子印迹技术[12]、离子迁移率谱仪预富集进样技术[13]等被广泛用于有机磷农药的检测，但这些技能易受外部环境的干扰。因此需要开发更可靠，便捷的有机磷农药检测方法。

氯化血红素（Hemin）作为辣根过氧化物酶（HRP）的辅基，对HRP的催化活性至关重要。HRP化学本质是蛋白质，在应用过程中易受到外界环境的影响，成本较高，且反应条件比较严格[14]。相对于HRP，Hemin的获取成本较低、易储存、不易变性，且在生物降解中更加稳定。近年来，研究者采用少量Hemin与G四联体构建类辣根过氧化物酶生物传感器，并成功用于赭曲霉毒素A[15]、癌症标志物[16]、蛋白质[17]等的检测。本研究组也发现高浓度的Hemin本身也具有过氧化物酶的活性，且核酸适配体对Hemin催化活性有一定抑制作用，在此基础上建立了基于Hemin催化活性比色检测As的方法[18]。迄今为止，利用Hemin进行有机磷农药的比色检测还鲜有报道。本研究建立了基于增强Hemin催化活性进行比色检测水胺硫磷的方法，考察了Hemin的酶促反应动力学，发现水胺硫磷的加入会进一步提高Hemin对底物3，3′，5，5′四甲基联苯胺（TMB）的亲和力，增强其催化活性，加快了底物TMB的氧化速度，使得反应体系颜色发生显著变化，从而实现水胺硫磷的比色检测。本方法具有操作简单、快速、灵敏度高、特异性好且裸眼可辨等优点，可应用于农产品中水胺硫磷残留的检测。

2实验部分

2.1仪器与试剂

吸收光谱用全波长读数仪（ThermoScientificMultiskanGOMicroplateSpectrophotomer，USA）记录。

Hemin（美国SigmaAldrich公司）；NaH2PO4、TMB、H2O2（30%）、水胺硫磷及其它有机磷的竞争性农药（阿拉丁股份有限公司（上海））；其它试剂均为市售分析纯试剂。实验所用水均为三次蒸馏水。

2.2水胺硫磷检测

将3.5μL2mmol/LHemin溶液与不同浓度的水胺硫磷标准液（总体积≤5μL）充分混匀后，30℃孵育30min，然后加入一定体积20mmol/LNaH2PO4溶液（pH3.0），最后加入10μL2mol/LH2O2和10μL5mmol/LTMB混合液，补加蒸馏水至500μL，充分混匀，检测其吸收光谱并计算ΔA（450nm），其中ΔA=A（水胺硫磷，450nm）-A（空白，450nm）。在空白对照实验中，用5μL水替代不同浓度的水胺硫磷溶液。

2.3實际样品分析

分别对两个不同地点的废水和西红柿汁等样品进行检测。废水分别从贵州大学附近的河流和农田采集，并分别命名为废水1和废水2，用0.22μm膜过滤，待测。西红柿购自当地市场，先榨成汁，并在1000r/min条件下离心20min，上清液用0.22μm膜过滤，待测[19]。在实际样品中，分别加入2和10mg/L水胺硫磷标准溶液，测定回收率。

3结果与讨论

3.1实验原理

前期研究发现，当TMB被催化氧化后，其二苯胺基上的N原子会失去一个电子，使得TMB分子带一个正电荷，此时溶液的颜色为蓝色。当Hemin与底物的浓度比增加后，则反应体系的催化活性会进一步增强，导致所有TMB分子中的2个N原子均失去电子，此时溶液的颜色为黄色[18]。图1展示了本方法检测水胺硫磷的基本过程。在H2O2存在下，Hemin催化氧化底物TMB，使其失去1个电子，导致反应体系由无色透明变为蓝绿色。水胺硫磷中的氨基、芳香环或硫基与Hemin的亚铁卟啉环之间，可以通过ππ堆积或配位键[19]提高Hemin对底物的亲和力，增强其催化功能，能进一步使TMB分子再失去1个电子，反应体系由蓝绿色变为黄色，且颜色变化程度与水胺硫磷浓度成正比，基于此建立裸眼可辨水胺硫磷的检测方法。

3.2反应条件的优化

为了提高水胺硫磷的检测灵敏度，本研究对Hemin、TMB的浓度及pH值等因素进行了考察。实验选择450nm作为特征吸收峰。

3.2.1Hemin和TMB浓度对水胺硫磷的检测影响在不同浓度Hemin和TMB条件下，反应体系中加入50μg/L水胺硫磷后的吸光值变化见图2A，当Hemin、TMB浓度分别为14μmol/L、0.10mmol/L时，其ΔA（450nm）达到最大，因此选择该浓度作为实验的最佳条件。

3.2.2不同pH对Hemin催化活性的影响Hemin、TMB浓度分别为14μmol/L、0.10mmol/L的条件下，考察了溶液的pH值对Hemin催化活性的影响。用HCl和NaOH调节溶液pH值，并测定其吸收光谱及在450nm处的吸光值，结果如图2B和2C所示。在pH5～7范围内，TMB被催化氧化后，其二苯胺基上的N原子会失去1个电子，溶液呈现蓝色。但在pH2～4范围内，反应体系的催化活性会进一步增强，导致所有TMB分子中的2个N原子均失去电子，此时溶液的颜色为黄色。然而，当溶液的pH=3.0时，更有利于Hemin催化底物TMB，因此本实验选择pH3.0进行测定。

3.3反应动力学

根据酶动力学理论，进一步分析Hemin的催化机理。以H2O2、TMB为底物，研究水胺硫磷加入前后对Hemin催化活性的影响，并得出相应的动力学参数。在图3A和3B中，通过改变TMB和H2O2浓度得到MichaelisMenten曲线。进一步分析，得其Doublereciprocal曲线（图3C和3D），由Doublereciprocal方程1/V=Km/（Vm＼[s＼]）+1/Vm得出的MichaelisMenten常数（Km）和最大反应速度（Vm）见表1。通过比较不同种类催化剂的动力学参数，Hemin对TMB和H2O2的Km都高于HRP及Fe3O4，说明其对底物的亲和力低于HRP及Fe3O4[21]。从图3C和3D可见，这些平行线揭示了“乒乓机理”，说明Hemin先催化H2O2产生自由基，后者再与底物TMB反应产生颜色信号[20，21]。体系中加入50μg/L水胺硫磷后，Hemin催化TMB的MichaelisMenten曲线见图3E和3F，作出其Doublereciprocal曲线（图3G和3H），计算得出的MichaelisMenten常数（Km）和最大反应速度（Vm）见表1。

Km值均降低，且Vm也在提高，说明其对底物〖ZH（的亲和力都在增加，并加快了反应速度，这些结果表明水胺硫磷能增强Hemin的催化活性。一般酶类物质的催化功能与其尺寸效应、形貌及表面微环境等密切有关[20]。本研究组曾发现，水胺硫磷中的氨基、芳香环或硫基与Hemin的亚铁卟啉环之间可以通过ππ堆积或配位键实现Hemin分子的可控聚集[19]。在本研究中，一定程度聚集的Hemin可能会提供底物更大的接触面积，增强对底物的亲和力，有利于提高其催化活性。根据〖ZH）Hemin反应动力学，进一步证实了本方法的工作原理。

3.4分析应用

在优化的条件下，加入不同浓度的水胺硫磷（2～100μg/L），并记录其ΔA（450nm）值随时间的变化、特定时间下的吸收光谱及ΔA（450nm）值。从图4A可见，在第4min，当水胺硫磷浓度达到60μg/L时，其ΔA（450nm）值达到最大，且随着水胺硫磷浓度的增大，ΔA（450nm）值几乎不再变化，因此本方法选择反应时间为4min。从图4B和4C可见，随着水胺硫磷浓度增加，溶液由蓝绿色变成黄色，ΔA（450nm）逐渐升高，当水胺硫磷超过60μg/L时，ΔA（450nm）值趋于稳定。本方法通过裸眼可辨的检出限为30μg/L，在低浓度水胺硫磷条件下，ΔA（450nm）与其浓度在2～30μg/L范围内呈线性关系（图4C插图），检出限（3σ[22，23]）为1.2μg/L，远低于美国环保局（US.EPA）和中国农业部制定的农产品中农药残留最大限量标准（100μg/L）。当水胺硫磷浓度为100μg/L时，反应体系颜色变化非常显著，可通过裸眼快速辨别农产品中水胺硫磷农药是否超标。

将本方法用于水胺硫磷的特异性检测及实际样品分析，结果如图5及表2所示。在图5中，除含水胺硫磷反应体系颜色变成黄色外，其余如辛硫磷、乐果等竞争性有机磷农药的反应体系颜色均为蓝绿色，且其它有机磷农药的测定值远低于水胺硫磷，表明本方法可以特异性检测水胺硫磷。在其它有〖CM（44机磷农药存在时，对应的ΔA（450nm）值和同浓度的水胺硫磷几乎相同，表明其它有机磷农药对水胺〖CM）

4结论

建立了一种基于增强Hemin催化活性比色检测水胺硫磷的方法。结果表明，水胺硫磷能提高Hemin對底物的亲和力，增强Hemin的催化活性，加快氧化底物TMB，使得反应体系颜色发生显著变化，从而实现裸眼可辨水胺硫磷的检测。本方法裸眼可辨水胺硫磷的检出限为30μg/L，方法检出限为1.2μg/L，在实际样品中对水胺硫磷检测的加标回收率为93.0%～113.0%，且特异性好，操作便捷，不需要依赖大型仪器，因而可广泛应用于农产品中水胺硫磷残留的检测。Hemin具有稳定性高且价格低廉等优势，有良好的应用潜能。

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AbstractAsimplecolorimetricmethodfordetectionofisocarbophoswasdevelopedbasedontheenhancedperoxidaselikeactivityofhemin.Hemincouldcatalyzetheoxidationofperoxidasesubstrate3，3′，5，5′tetramethylbenzidine（TMB）byH2O2，whichmadeTMBtoloseoneelectronandcausedreactionsolutioncolorchangingfrominitialtransparenttobluegreen.Addingisocarbophosimprovedheminaffinitytosubstrates，whichfurtherenhancedperoxidaselikeactivityofheminandmadeTMBtolosetwoelectrons.ThecolorofTMBsolutionwasfurtherchangedfrombluegreentoyellow，andthedegreeofcolorchangewasproportionaltotheconcentrationofisocarbophos.Undertheoptimalconditions，thepresentanalyticalmethodforisocarbophosdetectionhadadynamicrangefrom2μg/Lto100μg/Lwithadetectionlimitof1.2μg/L（3σ）.Theselectivityassaydemonstratedthatotherorganophosphoruspesticidesexhibitednegligibleinterferencesforisocarbophosdetection.Theapplicationoftheproposedmethodinthepracticalsamplesshowedthatthemeanrecoveryofisocarbophoswasintherangeof94.4%-113.0%，thusitcouldbewidelyappliedtorapidlyandsensitivelydetectisocarbophosintheagriculturalproducts.

KeywordsHemin；Isocarbophos；Peroxidase；Organophosphoruspesticides

（Received30November2016；accepted3January2017）

ThisworkwassupportedbytheNationalNaturalScienceFoundationofChina（Nos.21565009，21205020）.