猪伪狂犬病基因缺失灭活疫苗（JS-2012-△gI/gE株）最小免疫剂量测定

童 武，李国新，郑 浩，刘 飞，梁 超，田 青，李 林，曹艳云，武吉强，王 涛，郑旭晨，单同领，童光志

（1.中国农业科学院上海兽医研究所，上海 200241； 2.江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心,扬州 225009 ）

·研究论文·

猪伪狂犬病基因缺失灭活疫苗（JS-2012-△gI/gE株）最小免疫剂量测定

童 武1,2，李国新1,2，郑 浩1,2，刘 飞1，梁 超1，田 青1，李 林1，曹艳云1，武吉强1，王 涛1，郑旭晨1，单同领1,2，童光志1,2

（1.中国农业科学院上海兽医研究所，上海 200241； 2.江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心,扬州 225009 ）

为了确定猪伪狂犬病基因缺失灭活疫苗（PRV JS-2012-△gI/gE株）的最小免疫剂量，本研究将25头14日龄仔猪（猪伪狂犬病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒、猪圆环病毒2型病原抗体均为阴性）随机分成5组，每组5头。第1～4组分别接种猪伪狂犬病灭活疫苗（PRV JS-2012-△gI/gE株）0.5、1、2、3 mL/头，免疫28 d后各组参照第1次免疫的剂量分别加强免疫1次，第5组实验猪不做处理作为阴性对照。免疫后，每周采集各组猪血清检测抗体水平。待第2次免疫28 d后，5组实验猪均滴鼻接种PRV JS-2012株第5代强毒2 mL， 含病毒105.0TCID50/头。结果表明：第1次免疫后14 d，第2～4组猪 PRV gB 抗体全部转为阳性，而第1组猪在第1次免疫后21 d全部转阳。攻毒后，第1组有1头猪发病，表现精神沉郁、厌食和轻微神经症状，其余4头猪有一过性的发热，无任何其他异常临床表现，保护率为80%；第2～4组，实验猪只有一过性的发热，无任何其他异常临床表现，保护率为100%；第5组猪在攻毒后48 h，体温迅速上升到41℃以上，并表现为明显的精神沉郁、厌食和神经症状，发病率为100%，死亡率为40%。由此确定猪伪狂犬病灭活疫苗（JS-2012-△gI/gE株）最小免疫剂量为1 mL/头。

伪狂犬病毒；灭活疫苗; 最小免疫剂量

猪伪狂犬病是影响我国乃至世界养猪业健康发展的重要传染性疾病之一，由伪狂犬病毒感染（Pseudorabies virus，PRV）引起的，以发热、奇痒、脑脊髓炎为主要特征[1]。不同年龄段的猪都可感染，主要引起妊娠母猪流产、死胎、木乃伊胎，哺乳仔猪高死亡率，及种猪不育[1-3]。我国于20世纪40年代、60年代分别在猫和猪群中发现PRV，至今该病毒仍在我国猪群中广泛流行，严重威胁着我国猪群的健康[4]，并造成了严重经济损失[5]。对猪伪狂犬病的防控与净化最有效的手段是接种基因缺失疫苗并配合血清学检测来完成[6,7]。20世纪90年代我国从匈牙利引进Bartha k61疫苗株，对猪群进行免疫防控，伪狂犬疫情得到了有效的控制。但2011年以来，我国免疫猪群大面积爆发了伪狂犬疫情，经专家证实该疫情由伪狂犬病毒变异株引起。伪狂犬病毒变异毒株感染猪较经典伪狂犬强毒感染猪的发病速度更快、临床症状和病理变化更严重、死亡率也更高。同时免疫保护性试验结果表明，Bartha k61疫苗免疫猪不能有效抵抗伪狂犬病毒变异株的攻击[8-13]。

目前，猪伪狂犬病毒变异株已经在全国范围内流行，疫病防控形势严峻，国内很多研究学者都在研制针对伪狂犬病毒变异株的疫苗[14-19]。本实验室运用同源重组的方法成功构建出了伪狂犬病疫苗候选株PRV JS-2012-△gI/gE，以PRV JS-2012-△gI/gE毒株为种毒研制猪伪狂犬病活疫苗和灭活疫苗[20]。本研究采用不同剂量的猪伪狂犬病灭活疫苗（PRVJS-2012-△gI/gE株），对仔猪进行免疫，然后滴鼻接种PRV JS-2012第5代强毒，检测灭活疫苗的免疫效果，从而确定其最小免疫剂量。

1 材料与方法

1.1 疫苗 猪伪狂犬病灭活疫苗（PRV JS-2012-△gI/ gE株）由中国农业科学院上海兽医研究所猪病研究室制备并保存。

1.2 实验猪、实验试剂及耗材 阴性实验猪均购自南京某猪场；伪狂犬病毒gB和gE抗体检测试剂盒均购自IDEXX公司；动物实验所用的注射器、采血器、防护服、体温计等均购自上海基音生物科技有限公司。

1.3 动物试验 将25头14日龄PRV、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒、猪圆环病毒2型抗原抗体均为阴性的健康仔猪随机分成5组，每组5头。第1～4组分别接种猪伪狂犬病灭活疫苗（PRV JS-2012-△gI/ gE株）0.5、1、2、3 mL/头，免疫28 d后各组参照第1次免疫的剂量分别加强免疫1次，第5组实验猪不做处理作为阴性对照。待第2次免疫后28 d，5组实验猪均滴鼻接种PRV JS-2012第5代强毒2 mL， 含105TCID50/ 头，观察临床表现（体温、呼吸症状、食欲、生长状态和神经症状等）。同时，分别在免疫后0、7、14、21、28、35、42、49、56 d，以及攻毒后1～14 d采集血液并分离血清。攻毒后14 d剖杀剩余实验猪，进行组织病理学观察。

1.4 PRV ELISA抗体检测 将攻毒前不同时间点采集的猪血清，按IDEXX公司 PRV gB和gE抗体检测试剂盒说明检测针对PRV的特异性gB和gE抗体变化。

1.5 临床及组织病理变化观察 对攻毒试验中发病死亡或试验结束剖杀的仔猪，进行病理剖检。取脑、心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、腹股沟淋巴结等组织进行眼观病变并拍照。所取组织脏器用10%中性福尔马林固定，制作病理切片，在显微镜下观察病理变化。

2 结果

2.1 临床症状 各疫苗免疫组的实验猪在两次接种疫苗后均无过敏反应，接种部位无炎性反应。疫苗接种后除个别仔猪出现短暂的厌食外，其余实验猪均无异常表现。攻毒后，第1组有1头猪d 3开始发病，表现精神沉郁、厌食和轻微的神经症状，其余4头只有一过性的发热，无任何其他异常临床表现，保护率为80%；第2～4组实验猪有一过性的发热，无任何其他异常临床表现，保护率为100%；第5组在攻毒后48 h，5头实验猪体温均迅速上升到41℃以上，并表现为明显的精神沉郁、厌食和神经症状，并在攻毒后的d 6和d 7各死亡1头仔猪，发病率为100%，死亡率为40%，结果详见表1。

表1 不同剂量组免疫攻毒后临床表现统计结果Table 1 Protection effi cacy of swine pseudorabies inactivated vaccine with different dosage

2.2 PRV的特异性抗体监测 PRV gB抗体检测结果显示，第2～4组在第1次免疫后7 d开始转阳，d 14全部转阳。第1组在第1次免疫后14 d开始转阳，d 21全部转阳，抗体转阳情况整体要比第2～4组晚1周。第5组在对应的各时间点PRV gB抗体均为阴性。PRV gE抗体在攻毒前的各个时间点均为阴性（图1）。

2.3 临床眼观病理变化 对攻毒后死亡或试验结束迫杀的仔猪进行解剖。取脑、心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、腹股沟淋巴结等组织进行眼观病变拍照，结果见图2。第1组少数实验猪脑脊液明显增多，脑膜肿胀增厚、血管扩张，并伴随少量出血；肺脏轻度气肿，并伴有出血、坏死，肉实变；腹股沟淋巴结轻微充血肿胀；脾脏边缘轻微淤血且肿大；肾脏可见少量点状出血；肝脏边缘淤血坏死。第2组个别实验猪脑脊液稍有增多；肺脏轻度气肿；腹股沟淋巴结、脾脏、肾脏、肝脏未见明显眼观病理变化。第3～4组（2 mL和3 mL疫苗接种组），所有实验猪的脑、心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、腹股沟淋巴结等组织脏器均未见明显眼观病理变化。第5组（空白对照组）病死或最终存活的实验仔猪大都体型消瘦且被毛粗乱，剖检见脑脊液明显增多、脑膜肿胀且明显增厚，血管扩张并伴随严重出血；肺脏气肿，并伴有出血、坏死、大面积肉实变；腹股沟淋巴结明显充血肿胀；脾脏边缘明显淤血且肿大，肾脏可见大量点状出血；肝脏边缘严重淤血坏死。

2.4 组织病理学观察 对攻毒后死亡或试验结束迫杀的仔猪进行解剖后，每头猪取脑、心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、腹股沟淋巴结组织，用10% 中性福尔马林固定，选取脑、肺脏、肝脏进行病理切片制作，结果见图3。第1组实验猪脑膜表面血管高度扩张充血、出血，脑水肿；肺脏淤血水肿；肝脏淤血。第2组实验猪脑网膜血管扩张充血、炎性渗出；肺脏组织未见明显病理变化；肝脏未见淤血。第3组实验猪脑和肺脏组织均未见明显病理变化；肝脏未见淤血。第4组实验猪脑和肺脏组织均未见明显病理变化；肝脏未见淤血。第5组实验猪脑脑蛛网膜下腔严重出血并扩张、脑膜出血，脑水肿；肺泡出血，细支气管出血；肝脏淤血。

3 讨论

2011年以来，由PRV变异株引起的猪伪狂犬病在我国大面积爆发并流行，且传统的伪狂犬病疫苗已不能为免疫猪群提供完全的保护，防控形势严峻。因此本实验针对伪狂犬病毒变异株的疫苗研究迅速展开。童武等[20]运用同源重组的方法成功构建出了伪狂犬病疫苗候选株PRV JS-2012-△gI/gE，以PRV JS-2012-△gI/gE毒株为种毒研制猪伪狂犬病活疫苗和灭活疫苗，结果表明该活疫苗与灭活疫苗对仔猪均安全，且具有很好的免疫原性。本研究主要是测定猪伪狂犬病灭活疫苗（PRV JS-2012-△gI/ gE株）的最小免疫剂量。研究结果显示，0.5 mL疫苗免疫组在首次免疫后14 d开始转为阳性，1、2、3 mL疫苗免疫组首免后7 d开始转阳，比0.5mL疫苗免疫组提前大约1周；在临床症状方面，对照组具有明显的神经现象并出现死亡，0.5 mL疫苗免疫组攻毒后有轻微神经症状，1、2、3 mL疫苗免疫组（除一过性发热以外）均表现正常；在病理变化方面，对照组病主要脏器（肺脏、肝脏、脾脏、肾脏、脑、腹股沟淋巴结）均出现比较明显的病变；0.5 mL疫苗免疫组在脑组织、肺脏、肝脏和腹股沟淋巴结也有较明显的肉眼变化，其余疫苗免疫组的组织脏器基本未出现明显病变；在组织病理切片方面，对照组脑组织病变严重、肺泡及肝细胞均有充血，0.5 mL疫苗免疫组脑组织也有较为严重的出血、肺泡水肿和肝细胞病变，其他疫苗免疫组的组织切片病变不明显。

图1 免疫后各组猪血清中PRV特异性抗体动态变化Fig. 1 PRV specifi c antibody responses in piglets of different groups after imoculation注∶ S/N 值小于0.6 判定为抗体阳性. A∶ PRV gB抗体; B∶ PRV gE抗体Note∶ S/N ratios less than 0.6 were considered positive. A∶ PRV gB specifi c antibody; B∶ PRV gE specifi c antibody

图2 攻毒后仔猪的剖解病变观察Fig. 2 The autopsy lesions of piglets after challenge

图3 攻毒后仔猪不同组织的病理切片观察（HE，200×）Fig. 3 Pathological section observation of differet tissues in piglets after challenge（HE, 200×）

研究结果表明，在一定的范围内，随着免疫剂量的提高，免疫猪的抗体产生时间越早，攻毒后的临床症状和病理变化越轻，猪伪狂犬病灭活疫苗的免疫保护效力与免疫剂量呈正相关。本研究发现猪伪狂犬病灭活疫苗免疫不能够阻止强毒感染，即使是高剂量（3 mL）免疫猪在攻毒后也会有一过性的发热反应，但灭活疫苗免疫能够阻止猪发病（除一过性发热外）和减少排毒。综合以上数据，我们确定猪伪狂犬病灭活疫苗（PRV JS-2012-△gI/gE株）的最小免疫剂量为1mL/头份。

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DETERMINATION OF THE MINIMUM IMMUNIZATION DOSE OF SWINE PSEUDORABIES INACTIVATED VACCINE

TONG Wu1,2, LI Guo-xin1,2, ZHENG Hao1,2, LIU Fei1, LIANG Chao1, TIAN Qing1, LI Lin1, CAO Yanyun1, WU Ji-qiang1, WANG Tao1, ZHENG Xu-chen1, SHAN Tong-ling1,2, TONG Guang-zhi1,2

(1. Shanghai Veterinary Research Institute, CAAS, Shanghai 200241, China; 2. Jiangsu Co-innovation Center for Prevention and Control of Important Animal Infectious Diseases and Zoonoses, Yangzhou 225009, China)

In order to determine the minimum immune dose of the inactivated vaccine of swine Pseudorabies (PRV JS - 2012 - gI/gE strains), twenty fi ve 14-day-old piglets, seronegative for Pseudorabies virus(PRV), Porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV), Porcine circovirus (PCV2) and Classical swine fever virus (CSFV)antibodies, were selected randomly and divided equally into 5 groups. Pigs in group 1, 2, 3 and 4 were injected with 0.5, 1, 2 and 3 mL of swine pseudorabies inactivated vaccines (PRV JS -2012- gI/gE strains), respectively. Twenty eight days later, a booster vaccination was given at the same dosage. Group 5 was control group without vaccination. On 28 days post second immunization, all pigs were infected with 105TCID50JS-2012-F5 strain. The results showed that PRV gB antibodies were positive in group 2-4 at 14 dpi(days post infection), while the gB antibodies became positive in group 1 at 21 dpi. After infected with JS-2012-F5 strain, one piglet in group 1 showed clinical symptoms of pseudorabies disease, and the others only showed transient fever without any other abnormal clinical manifestations, which meant the protection rate was 80%. In group 2-4, piglets showed transient fever without any other clinical symptoms, so the protection rate was 100%. The temperature of the piglets in group 5 rose quickly above 41℃ after infected with JS-201-F5 for 48 hours, and the piglets showed obvious depression, anorexia and neurological symptoms, which indicated the incidence rate in control group was 100%. According to the above results, the minimal effective dose of vaccines against Pseudorabies virus was 1 mL per piglets.

Pseudorabies virus; inactivated vaccine; minimum immunization dose

S852.659.1

A

1674-6422（2017）01-0026-06

2016-03-30

上海市自然科学基金项目（14ZR1448900)；上海市科技兴农重点攻关项目（沪农科攻字（2015）第1-7号）；国家生猪现代产业技术体系项目（CARS-36）；公益性行业（农业）科研专项（201203039）

童武，男，硕士，助理研究员，主要从事猪伪狂犬病毒及其疫苗的研究

童光志，E-mail:gztong@shvri.ac.cn