毛蕊异黄酮增强顺铂对胃癌细胞增殖的抑制作用

周立霞，吴月明，李娜，杨祎，秦雪云

（锦州医科大学附属第三医院肿瘤科，辽宁锦州121000）

毛蕊异黄酮增强顺铂对胃癌细胞增殖的抑制作用

周立霞，吴月明，李娜，杨祎，秦雪云

（锦州医科大学附属第三医院肿瘤科，辽宁锦州121000）

目的观察毛蕊异黄酮对顺铂抑制胃癌细胞增殖的增强作用。方法将BGC823细胞分为4组，分别用生理盐水、顺铂、毛蕊异黄酮和2种药物联合处理，检测不同时间点、不同处理因素下的细胞增殖情况。进一步检测影响细胞增殖的相关蛋白，确定毛蕊异黄酮联合顺铂抑制胃癌细胞增殖的方式。结果对细胞作用24 h后，20 μg/mL顺铂，10 μg/mL毛蕊异黄酮，以及2种药物联合处理组对BGC823细胞的增殖抑制率分别为56.44%±2.08%，9.52%±2.77%和74.44%±0.82%。药物联合使用后对细胞的抑制率明显高于单个药物处理组，各组数据间差异有统计学意义（P＜0.05）。并且无论是在蛋白水平还是RNA水平上，毛蕊异黄酮均可以显著增强顺铂对Cyclin D1，CDK4和CDK6蛋白的抑制作用。结论毛蕊异黄酮可以显著提高顺铂对BGC823细胞增殖的抑制率，2种药物联合使用可以降低顺铂单独使用所导致的毒副作用。

毛蕊异黄酮；顺铂；BGC823；胃癌；增殖

胃癌是我国最为常见的恶性肿瘤之一，严重威胁着人们的健康［1］。虽然近几十年来，胃癌的发病率和死亡率一直在稳步下降，但是它仍然是肿瘤致死的第二大原因［2］。目前手术治疗仍然是胃癌最有效的治疗方法［3］，术后的放化疗也能在一定程度上提高患者的生存时间，但是现有的化疗药物通常会引发骨髓抑制反应等严重的不良反应［4］，患者的生存质量往往不高，因此，亟待寻找新的药物与化疗药物联合使用，以期待降低化疗药物的毒副作用。

毛蕊异黄酮是大豆异黄酮的主要成分，是一种应用广泛的天然活性化合物，具有抗氧化和抗炎活性［5］。最近的研究［6］表明，毛蕊异黄酮可以通过抑制AKT通路来抑制乳腺癌细胞的生长。顺铂是一种化疗药物，广泛应用于临床多种肿瘤的术后化疗中。在胃癌细胞中，顺铂可以通过作用于AKT和P53等通路影响胃癌的生长与侵袭转移能力。然而，应用顺铂时往往会引发严重的胃肠道反应等多种不良反应，而且其化疗效果对不同人群差异较大，个体耐受性较高［7⁃10］。为此，想通过研究观察联合使用2种药物是否能够在一定程度上更好的治疗胃癌。

本研究以BGC823细胞作为研究对象，观察毛蕊异黄酮与顺铂联合作用对细胞增殖的抑制作用，进一步检测2种药物发挥抑制细胞增殖作用的方式，以期待毛蕊异黄酮能够与顺铂联合使用来改善胃癌患者化疗药物的使用剂量，减少化疗的不良反应。

1 材料与方法

1.1 材料

人胃癌BGC823细胞系，DMEM培养基（Invitro⁃gen公司，美国），胎牛血清（天津灏洋公司），毛蕊异黄酮（Selleck公司，美国），顺铂注射液（云南生物谷药业股份有限公司），四甲基偶氮唑蓝（MTT），Cyclin D1、CDK4、CDK6和GAPDH（Santa公司，美国），SYBR Green（Promega公司，美国）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养：将BGC823细胞培养于含体积分数10%胎牛血清的DMEM培养基中，置于CO2培养箱中培养。

1.2.2 药物处理浓度：顺铂为临床常用的化疗药物，根据伯格公式C=20×D（C单位为μg/mL，D为临床剂量单位mg·kg-1·d-1）和体表面积计算公式S= 1.15+（m-30）×0.1×5-1（其中m＞30 kg）计算出MTT所需药物浓度。毛蕊异黄酮取10 μg/mL、20 μg/mL和40 μg/mL 3个浓度。

1.2.3 MTT实验：BGC823细胞以1×105/mL浓度接种于96孔培养板，12 h后添加不同浓度的药物。每个浓度药物处理后分别取0 h、12 h、24 h、36 h和48 h，使用MTT测量细胞增殖曲线。以DMSO处理作为对照。于0 h、12 h、24 h、36 h和48 h分别加入5 mg/mL MTT 10 μL，培养4 h后弃上清，每孔中加入DMSO 200 μL，溶解后后在490 nm处记录吸光值。抑制率计算公式：抑制率=1-（剂量组平均OD值/对照组平均OD值）×100%。

1.2.4 Western blotting：药物处理24 h后收集细胞，裂解提取蛋白。取等量蛋白进行SDS⁃PAGE电泳、100 V转膜1 h后，室温封闭1 h。一抗（Cyclin D1、CDK4、CDK6和GAPDH）1∶200孵育过夜，二抗室温孵育1 h。ECL发光仪发光。

1.2.5 实时PCR检测：使用TRIZOL法提取RNA并反转录成cDNA，参照SYBR Green说明书进行实时PCR反应。所用引物为Cyclin D1，F：5’⁃CCGAG GAGCTGCTGCAAATGGAG⁃3’；R：5’⁃CGTGCGGGG TCATTGCGGC⁃3’；CDK4，F：5’⁃CAGAGCTCTTAGC CGAGCGT⁃3’；R：5’⁃GGCACCGACACCAATTTCA G⁃3’；CDK6，F：5’⁃GTCTGATTACCTGCTCCGC⁃3’；R：5’⁃CCTCGAAGCGAAGTCCTC⁃3’；GAPDH，F：5’⁃CATCCCTTCTCCCCACACAC⁃3’；R：5’⁃AGTCCC AGGGCTTTGATTTG⁃3’。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 药物对BGC823细胞增殖的影响

2.1.1 顺铂处理组：采用不同浓度的顺铂处理BGC823细胞，取0 h、12 h、24 h、36 h和48 h分别检测细胞增殖状态，顺铂可显著抑制BGC823细胞增殖，各组结果之间差异有统计学意义（P＜0.01）。见图1、2，表1。

2.1.2 毛蕊异黄酮处理组：不同浓度的毛蕊异黄酮加入BGC823细胞中，0 h、12 h、24 h、36 h和48 h后，毛蕊异黄酮可抑制BGC823细胞的增殖，组间差异有统计学意义（P＜0.05），其对细胞的增殖抑制作用随着剂量和时间增加。见图3、4，表2。

图1 顺铂作用24 h的BGC823细胞光镜图片×100Fig.1Light microscope image of BGC823 cells treated by cisplatin for 24 h×100

2.1.3 毛蕊异黄酮联合顺铂处理组：采用20 μg/mL顺铂与10 μg/mL毛蕊异黄酮联合作用BGC823细胞，药物联用后对细胞增殖的抑制能起到协同作用，组间差异有统计学意义（P＜0.05）。见图5、6，表3。

图2 顺铂作用下BGC823细胞的增殖情况（n=3）Fig.2The proliferation of cells treated by cisplatin（n=3）

2.2 不同处理因素对BGC823细胞周期相关蛋白的影响

不同因素处理后，Cyclin D1、CDK4以及CDK6在蛋白水平和mRNA水平均受到不同程度的抑制。2种药物联合使用后对蛋白的抑制作用明显增强。见图7、8。

3 讨论

胃癌是世界范围内最常见的癌症死亡原因之一。虽然这种疾病的发病率和死亡率在过去的几十年里有显著的下降趋势，但仍然是人类健康的一大杀手［11⁃12］。根治性切除术是胃癌最常见的手术方法，但是很多患者会出现复发的现象，对于这些患者，全身化疗是主要的治疗方法［13］。顺铂作为应用最广泛、最有效的抗癌药物之一，可以通过抑制DNA的复制过程来抑制肿瘤［14］。顺铂通过抑制肿瘤细胞的增殖、促进肿瘤细胞凋亡来抑制肿瘤细胞的生长，与此同时它还可以抑制肿瘤细胞的侵袭转移。临床研究［15⁃17］表明，顺铂具有较强肾毒性、神经毒性，容易引起较剧烈的胃肠道反应及过敏反应。患者应用顺铂治疗后生存质量往往不高。有报道［5］指出，毛蕊异黄酮具有一定的抗肿瘤作用。毛蕊异黄酮可以显著抑制卵巢癌细胞的生长，也可以通过抑制AKT信号通路抑制乳腺癌的发生发展［18］。在骨肉瘤细胞中加入毛蕊异黄酮后，细胞的增殖与侵袭转移显著受到抑制［19⁃21］。但是目前未见毛蕊异黄酮作用于胃癌细胞的研究报道。

表1 顺铂对BGC823细胞增殖的抑制率（%，n=3）Tab.1The inhibition of proliferation treated by cisplatin（%，n=3）

图3 毛蕊异黄酮作用24 h的BGC823细胞光镜图片×100Fig.3Light microscope image of BGC823 cells treated by calycosin for 24 h×100

表2 毛蕊异黄酮对BGC823细胞增殖的抑制率（%，n=3）Tab.2The inhibition of proliferation treated by calycosin（%，n=3）

图4 毛蕊异黄酮作用下BGC823细胞的增殖情况（n=3）Fig.4The proliferation of cells treated by Calycosin（n=3）

图6 不同药物处理后细胞的增殖情况（n=3）Fig.6The proliferation of cells treated by different agents（n=3）

图5 毛蕊异黄酮和顺铂联合作用24 h的BGC823细胞光镜图片× 100Fig.5Light microscope image of BGC823 cells treated by caly⁃cosin and cisplatin for 24 h×100

本研究结果发现毛蕊异黄酮与顺铂联合应用后对BGC823细胞增殖的抑制作用显著高于2种药物单独使用时。细胞增殖实验显示二者均可以显著抑制BGC823细胞的增殖。进一步通过Western blotting与实时PCR研究发现，2种药物均可以在蛋白水平与RNA水平上抑制细胞周期相关蛋白Cyclin D1、CDK4和CDK6的表达。药物联合使用后，对这3种蛋白的抑制作用明显增强。这一系列研究结果均表明，毛蕊异黄酮和顺铂均可以抑制胃癌细胞BGC823细胞的增殖。

表3 不同药物对细胞增殖的抑制作用（%，n=3）Tab.3The inhibition of proliferation treated by different treatment（%，n=3）

图7 不同处理因素作用下BGC823细胞蛋白的变化Fig.7The proteins of BGC823 which treated by different agents

图8 不同处理因素作用下BGC823细胞mRNA水平的影响Fig.8The mRNA expression changes of BGC823 treated by different agents

综上所述，毛蕊异黄酮与顺铂联合应用后可以起到协同作用，本研究为临床上寻找胃癌化疗的辅助药物提供了理论基础。

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（编辑于溪）

Calycosin Enhance the Inhibitory Effect of Cisplatin on Proliferation of Gastric Cancer Cells

ZHOU Lixia，WU Yueming，LI Na，YANG Yi，QIN Xueyun
（Department of Oncology，The Third Affiliated Hospital of Jinzhou Medical University，Jinzhou 121000，China）

ObjectiveTo observe the effect of calycosin on cisplatin⁃induced inhibition of human gastric BGC823 cells.MethodsBGC823 cells were treated with different drugs：saline，cisplatin，calycosin and cisplatin combined with calycosin.MTT assays were used to detect the prolif⁃eration rate of BGC823 cell.Then the protein level and RNA level of cyclin D1，CDK4 and CDK6 were detected by Western blotting and Real⁃time PCR.ResultsThe proliferation inhibition rates of BGC823 cells treated with 20 μg/mL cisplatin，10 μg/mL meperoflavone，and combina⁃tion of the 2 drugs were 56.44%±2.08%，9.52%±2.77%and 74.44%±0.82%，respectively.The inhibition rate of the combination of drugs was significantly higher than that of the single drug treatment group（P＜0.05）.In addition，we found that calycosin can significantly enhance the inhi⁃bition of Cyclin D1，CDK4 and CDK6 by cisplatin in protein level and RNA level.ConclusionCalycosin can significantly increase the inhibitory rate of cisplatin on BGC823 cell proliferation，and the combination of the two drugs can reduce the side effects of cisplatin.

calycosin；cisplatin；BGC823；gastric；proliferation

R735.2

A

0258-4646（2017）01-0050-05

10.12007/j.issn.0258⁃4646.2017.01.011

周立霞（1981-），女，主治医师，博士研究生. E-mail：lyzhoulixia@sina.com

2016-02-22

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