5⁃Aza⁃CdR对DU145前列腺癌细胞系RNF180基因去甲基化作用的初步研究

王海光，姜华茂，左知润，龙湟哲，袁观远，贾凡振

（锦州医科大学附属第一医院泌尿外科，辽宁 锦州 121001）

5⁃Aza⁃CdR对DU145前列腺癌细胞系RNF180基因去甲基化作用的初步研究

王海光，姜华茂，左知润，龙湟哲，袁观远，贾凡振

（锦州医科大学附属第一医院泌尿外科，辽宁 锦州 121001）

目的 通过观察去甲基化药物5⁃Aza⁃CdR对DU145前列腺癌细胞系RNF180基因的影响，探讨前列腺癌细胞系中肿瘤抑制基因RNF180失活的机制和原因。方法 运用MTT法检测不同浓度（0、1、2、5、10、15、20 μmoI/L）5⁃Aza⁃CdR对前列腺癌细胞增殖能力的影响，同时筛选出1个最适药物浓度（5 μmoI/L）；分别采用Western blotting、实时PCR、甲基化特异性PCR（MSP）法检测最适药物浓度处理前后前列腺癌细胞中RNF180的表达情况。结果 在一定范围内，5⁃Aza⁃CdR对前列腺癌细胞DU145增殖能力的影响随着药物浓度的增加和药物处理时间的增长而加强（P＜0.05）；最适药物浓度处理后的前列腺癌细胞中RNF180蛋白及mRNA的表达量比处理前明显升高（P＜0.05），而启动子区的甲基化程度明显降低。结论 5⁃Aza⁃CdR能够逆转RNF180基因在DU145前列腺癌细胞中的高甲基化状态，解除RNF180基因表达沉默的状态。

5⁃Aza⁃CdR；前列腺癌；RNF180；去甲基化

RNF180是一种新发现的肿瘤抑制基因，而且近几年来有关肿瘤细胞组织中RNF180基因高甲基化的报道越来越多。有研究［1⁃2］表明，在胃癌组织中频繁地检测出RNF180DNA启动子甲基化。也有研究［3］表明，RNF180基因在正常肝组织中未发生甲基化，而在肝细胞癌组甲基化率较肝硬化组高。抑癌基因功能丧失可通过多种途径，现已证实DNA甲基化是基因突变及缺失之外抑癌基因失活的第3种机制，而且在某些情况下是其失活的唯一机制［4］，而且异常甲基化抑制抑癌基因表达的过程是可逆的，有可能通过应用去甲基化制剂诱导因甲基化失活的基因重新表达［5］。5⁃Aza⁃CdR是目前表观遗传学研究中使用最广泛的一类DNA去甲基化药物［6］，本研究通过研究去甲基化制剂5⁃Aza⁃CdR对体外培养的DU145前列腺癌细胞系RNF180基因启动子区甲基化状态及RNF180基因表达的影响，进一步探讨前列腺癌细胞系中肿瘤抑制基因RNF180失活的机制和原因，为前列腺癌的治疗提供新的依据和线索。

1 材料与方法

1.1 材料

人前列腺癌细胞系DU145购买于沈阳百思生物科技有限公司；RNF180一抗、5⁃aza⁃2’⁃deoxycyti⁃dine购自美国sigma公司；沈阳万类生物：全蛋白提取试剂盒、超敏ECL化学发光试剂盒、MTT细胞增殖及细胞检测试剂盒；德国ZYMO RESEARCH：EZ DNA Methylation⁃GoldTMKit、ZymoTaqTMPreMix；日本TaKaRa：RNA提取试剂盒、逆转录反应试剂盒；韩国BioNeer：2X GreenstarTMqPCR Master Mix。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养：应用含10%胎牛血清的MEM完全培养基，按照常规方法进行细胞复苏、换液、传代、收集和冻存。

1.2.2 MTT检测：取对数生长期的DU145前列腺癌细胞，进行细胞计数，并接种于96孔板（2×103/孔），每孔加入200 μL含10%血清完全培养基，于37℃、5%CO2培养箱内培养4 h。细胞完全贴壁生长后，将培养基更换为含有不同5⁃Aza⁃CdR药物浓度（0、1、2、5、10、15、20 μmoI/L）［7］的培养基，于37℃、5%CO2培养箱内培养，每24 h更换相同药物浓度的培养基并取出一板细胞按照MTT细胞增殖及细胞检测试剂盒说明进行操作，最后于酶标仪在490 nm波长处读取各孔光密度值。细胞生存率=实验组平均光密度值/对照组平均光密度值，细胞生长抑制率=（1-细胞生存率）×100%。

1.2.3 Western blotting检测RNF180蛋白表达：分别收集最适药物浓度的5⁃Aza⁃CdR作用72 h前后的DU145前列腺癌细胞，并按照试剂盒说明提取蛋白，并进行蛋白浓度检测及定量。配置12%SDS⁃PAGE凝胶，取上述蛋白制品每孔上样20 μL，电泳后将蛋白湿转至NC膜上，5%脱脂奶粉封闭1 h后加一抗室温孵育2 h，加二抗室温孵育1 h，最后加ECL发光显影。

1.2.4 实时PCR法测定RNF180mRNA的表达：分别收集最适药物浓度的5⁃Aza⁃CdR作用24 h、48 h和72 h前后的DU145前列腺癌细胞，按照RNA提取试剂盒说明提取RNA，并测定RNA浓度，取上述RNA制品，按照逆转录反应试剂盒说明将RNA逆转录为cDNA。取上述cDNA制品，按照2X Green StarTMqP⁃CR Master Mix试剂盒说明进行实时荧光定量PCR检测，引物设计见表1。反应体系为2X Green StarTMqPCR Master Mix 10 μL、上下游引物（100 μmol/L）各0.05 μL、DEPC水6 μL、cDNA样本4 μL。PCR扩增条件为95℃预变性30 s，95℃变性5 s，55℃退火34 s，72℃延伸34 s（59次循环），65℃终延伸5 s，0.5℃结束。

1.2.5 MSP检测甲基化状态：收集最适药物浓度的5⁃Aza⁃CdR作用72 h前后的DU145前列腺癌细胞后，按照试剂盒说明提取DNA，并测定DNA浓度，取上述DNA制品按照EZ DNA Methylation⁃GoldTMKit试剂盒说明进行亚硫酸氢盐修饰，修饰后的产物再次测定DNA浓度并定量（20 ng/μL），引物设计见表1。反应体系为ZymoTaqTMPreMix 10 μL、上下游引物（10 μmol/L）各2 μL、ddH2O 4 μL、DNA样本2 μL。PCR扩增条件为94℃预变性3 min，94℃变性20 s，58.5℃退火30 s，72℃延伸1 min（35次循环），72℃终延伸10 min，4℃结束。PCR扩增结束后于2%琼脂糖凝胶电泳（150 V、30 min），在紫外灯下观察条带。

1.3 统计学分析

应用SPSS 17.0统计软件进行统计分析。2组间差异比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

表1 引物设计序列Tab.1 Primer sequences

2 结果

2.1 MTT检测结果

采用不同浓度5⁃Aza⁃CdR对DU145前列腺癌细胞处理，在1、2、5 μmoI/L浓度时48 h的细胞生长抑制率比24 h的轻度升高（P＜0.05），而在处理72 h后的细胞生长抑制率较24 h和48 h显著升高（P＜0.05），在之后的10、15、20 μmoI/L浓度时3个处理时间的细胞生长抑制率之间的差异显著增加（P＜0.05），见图1。当药物浓度为1 μmoI/L时出现了对细胞生长的抑制作用，并且在一定范围内随着药物浓度的增加和药物处理时间的增长而加强，可见5⁃Aza⁃CdR对DU145细胞的生长有抑制作用，具有浓度依赖性和时间依赖性。根据MTT检测结果筛选出最适药物处理浓度，即5 μmoI/L，见表2。

图1 5⁃Aza⁃CdR对前列腺癌细胞DU145增殖能力的影响Fig.1 Effect of 5⁃Aza⁃CdR on the proliferation of prostate can⁃cer cell line DU145

表2 MTT检测结果Tab.2 Results of MTT

2.2 Western blotting检测RNF180蛋白表达的结果

如图2所示，通过对最适药物浓度的5⁃Aza⁃CdR处理72 h前后的前列腺癌细胞系DU145中RNF180蛋白表达的检测结果分析得出，RNF180蛋白在药物处理前的DU145细胞中低度表达，而在药物处理后的DU145细胞中的表达明显升高。

图2 5⁃Aza⁃CdR处理72 h前后DU145细胞中RNF180蛋白表达Western blotting检测结果Fig.2 Results of Western blotting on RNF180 expression in DU145 cells before and after the treatment of 5⁃Aza⁃CdR for 72 h

2.3 MSP检测结果

通过MSP法对最适药物浓度的5⁃Aza⁃CdR处理72 h前后的前列腺癌细胞系DU145中RNF180启动子区甲基化检测。MSP法结果显示，甲基化和非甲基化扩增条带均存在，说明前列腺癌细胞系DU145发生了非完全性甲基化，但是从结果可以明确地看出在5⁃Aza⁃CdR处理前的DU145细胞中RNF180启动子区的甲基化程度明显高于非甲基化程度，而在5⁃Aza⁃CdR处理72 h后的DU145细胞中RNF180启动子区的甲基化程度明显低于非甲基化程度，由此推断出甲基转移酶抑制剂5⁃Aza⁃CdR逆转了DU145细胞中RNF180启动子区的高甲基化状态，见图3。

2.4 实时PCR法测定RNF180mRNA表达的结果

通过实时荧光定量PCR法对最适药物浓度5⁃Aza⁃CdR处理24 h、48 h、72 h前后的前列腺癌细胞系DU145中RNF180mRNA表达量的检测可见，在3个处理时间段中药物处理后的DU145细胞中RNF180基因mRNA表达量比药物处理前明显升高，而且随着药物处理时间的延长RNF180mRNA的表达量也逐渐升高（P＜0.05），差异有统计学意义，见图4。

图3 5⁃Aza⁃CdR处理72 h前后DU145细胞中RNF180启动子区甲基化MSP检测结果Fig.3 Results of MSP on promoter region methylation of RNF180 in DU145 cells before and after the treatment of 5⁃Aza⁃CdR for 72 h

图4 实时荧光定量PCR检测5-Aza-CdR处理24 h、48 h、72 h前后DU145细胞中RNF180mRNA的相对表达量Fig.4 Results of real⁃time PCR on expression ofRNF180mRNA in DU145 cells before and after the treatment of 5⁃Aza⁃CdR for 24 h，48 h and 72 h

3 讨论

在许多工业化国家，前列腺癌是男性最常见的恶性肿瘤，是癌症死亡的第二大原因［8］，随着生物大规模分型技术的发展，基因组学日益受到人们的关注，基于表观遗传调控在肿瘤发病中的理论研究基础，DNA甲基化正在成为一类充满希望的生物标志物［9］。DNA甲基化是通过DNA甲基转移酶催化，将基因启动子和基因调控区CpG岛的一碳单位从S⁃腺苷蛋氨酸（AdoMet）转移到胞嘧啶的5’碳上［10］。已有大量研究［11⁃13］表明多种肿瘤抑制基因在前列腺癌中发生甲基化改变，如PDLIM4、GSTP1、RASSF1A等，从而导致其失去了对肿瘤的抑制作用。

RNF180是环指蛋白家族的一种新成员，它的功能类似E3泛素连接酶，据报道［14］RNF180参与许多生物流程，包括肿瘤的发生发展。在CHEUNG和DENG等［1⁃2］的研究中，明确了在胃癌的发生中RNF180基因表现为肿瘤抑制因子的作用以及RNF180参与胃癌的发生与发展，并且RNF180启动子不一致的甲基化程度在胃癌组织中导致RNF180低表达或未表达。5⁃Aza⁃CdR是一种胞嘧啶类似物，是一种高效的DNA甲基转移酶（DNMT）抑制剂，在DNA复制过程中，它可与DNMT不可逆性结合以降低该酶的甲基转移活性，从而达到较强的去甲基化作用，使表观遗传学沉默的基因去甲基化，逆转其恶性表型［15］。已有研究［16］证实在常见的前列腺癌细胞系中DU145细胞系的抑癌基因启动子区甲基化程度较高，因此本研究通过研究5⁃Aza⁃CdR对体外培养的DU145前列腺癌细胞系RNF180基因表达的影响，并进一步探讨前列腺癌细胞系中肿瘤抑制基因RNF180失活的机制和原因，为前列腺癌的治疗提供新的依据和线索。本研究采用MTT法检测不同浓度的5⁃Aza⁃CdR对DU145细胞增殖能力的影响，再根据Western blotting和实时PCR的检测结果分析得出，肿瘤抑制基因RNF180通过5⁃Aza⁃CdR的作用而被激活。为进一步研究证明5⁃Aza⁃CdR是通过对抑癌基因去甲基化而发挥其抗肿瘤作用，采用MSP法检测最适药物浓度处理前后细胞DU145中RNF180启动子区的甲基化程度。将之前相关的检测结果与MSP法检测结果结合起来分析后得出最终结论：前列腺癌细胞DU145中肿瘤抑制基因RNF180通过5⁃Aza⁃CdR的去甲基化作用而被激活，而且在一定范围内5⁃Aza⁃CdR的作用随着药物浓度的增加和药物处理时间的延长而加强。

综上所述，DU145前列腺癌细胞中肿瘤抑制基因RNF180启动子区的甲基化状态通过甲基转移酶抑制剂5⁃Aza⁃CdR的作用被逆转激活，从而使RNF180mRNA、蛋白等的表达增高，因此RNF180基因启动子区甲基化可能是其在前列腺癌中表达缺失或沉默的主要原因。本研究通过探讨5⁃Aza⁃CdR对DU145前列腺癌细胞系中RNF180基因表达的影响，不仅证实了RNF180基因失活的机制，同时也为前列腺癌的治疗提供了新的靶点和方向。

［1］CHEUNG KF，LAM CN，WU K，et al.Characterization of the gene

Preliminary Study on the Effect of 5⁃Aza⁃CdR on the Demethylation of RNF180 in Prostate Cancer Cell Line DU145

WANG Haiguang，JIANG Huamao，ZUO Zhirun，LONG Huangzhe，YUAN Guanyuan，JIA Fanzhen
（Department of Urology，The First Affiliated Hospital，Jinzhou Medical University，Jinzhou 121001，China）

Objective To investigate the mechanism and cause of the inactivation of tumor suppressor geneRNF180in prostate cancer cell line by observing the effect of 5⁃Aza⁃CdR on theRNF180gene in prostate cancer cell line DU145.Methods MTT method was adopted to study the effect of 5⁃Aza⁃CdR（0，1，2，5，10，15 and 20 μmoI/L）on the proliferation of prostate cancer cells.Western blotting，real⁃time PCR，and methyla⁃tion specific PCR（MSP）were separately used to detect the expression of RNF180 in prostate cancer cells before and after the treatment of the most suitable drug concentration（5 μmoI/L）.Results In a certain range，the effect of 5⁃Aza⁃CdR on the proliferation of prostate cancer cell line DU145 was increased with the increase of drug concentration and the time of drug treatment（P＜0.05）.After the treatment of the most suitable drug concentration，the protein and mRNA expression of RNF180 in prostate cancer cells was significantly increased（P＜0.05），but the methyla⁃tion of the promoter region was obviously decreased.Conclusion 5⁃Aza⁃CdR can reverse the methylation status ofRNF180gene in DU145 pros⁃tate cancer cell line，and relieve the silencing status ofRNF180gene expression.

5⁃Aza⁃CdR；prostate cancer；RNF180；demethylation

R737.25

A

0258-4646（2017）02-0140-05

10.12007/j.issn.0258⁃4646.2017.02.010

王海光（1990-），男，硕士研究生.

姜华茂，E-mail：lyyyjhm@163.com

2016-07-06

网络出版时间：