小儿安神补脑颗粒对氧化损伤细胞的保护作用及其抗氧化应激损伤机制※

● 高厚明 陈建平 石巧玲

小儿安神补脑颗粒对氧化损伤细胞的保护作用及其抗氧化应激损伤机制※

● 高厚明*陈建平 石巧玲

目的：本研究旨在探讨体外实验中小儿安神补脑颗粒在6-羟基多巴胺(6-OHDA)诱导的PC12细胞氧化损伤中的保护作用及其作用机制。方法：采用6-OHDA损伤PC12细胞制备PC12细胞氧化损伤模型。加入小儿安神补脑颗粒观察各组细胞生长情况。结果：小儿安神补脑颗粒能抑制6-OHDA诱导的细胞凋亡，显著增加细胞超氧化物歧化酶(SOD)和(GSH-Px)的活性，显著减少细胞中的丙二醛(MDA)的含量，同时显著提高PC12细胞核因子E2相关因子2(Nrf2)、血红素加氧酶-1(HO-1)和醌氧化还原酶-1(NQO-1)的mRNA表达。结论：小儿安神补脑颗粒对6-OHDA诱导的PC12细胞氧化损伤具有包含作用，其机制可能与其促进Nrf2基因表达，进而提高抗氧化蛋白表达水平，减轻氧化应激损伤有关。

小儿安神补脑颗粒 氧化应激 Nrf2 抗氧化蛋白

小儿多发性抽动症是一种儿童行为障碍性疾病。临床以多发性抽动、爆发性发声及猥亵语言、模仿言语伴奇癖生活方式为特征，呈复杂的、慢性神经精神疾病的表现[1]。小儿多发性抽动症是一种复杂的慢性现代病，因其病因及发病机制尚未明确，故治疗尚未有突破性进展。目前西医治疗该病主要采用神经阻滞剂如氟哌啶醇治疗，但其有效率仅为50%～70%左右。

中医认为，小儿多发性抽动症的主要病因为肝风内动，风痰上蒙，阻滞清窍，心神不宁，治疗以祛风化痰、补脑安神为原则。小儿安神补脑颗粒是课题组成员结合临床体会，针对本病病机研制而成的中药医院制剂。临床研究表明，小儿安神补脑颗粒是治疗小儿多发性抽动症的有效药物，与对照组氟哌啶醇比较有显著差异，远期效果也优于氟哌啶醇，复发率明显低于氟哌啶醇，克服了目前小儿多发性抽动症西药治疗的缺陷[2]。但目前该制剂相关的作用机制尚未明确，因而限制了其进一步的应用。在神经系统性疾病中，通常伴随脑内氧化应激损伤、神经再生障碍和神经营养因子缺失等，小儿安神补脑颗粒是否能通过改善神经系统性疾病中常见的病理状态而达到治疗小儿多发性抽动症还未见报道。因此，本研究拟通过建立PC12细胞的氧化应激细胞模型，评价小儿安神补脑颗粒的抗氧化应激作用，并评价小儿安神补脑颗粒是否通过Nrf2-ARE信号通路改善细胞防御体系。

1 材料

1.1 药物和试剂 小儿安神补脑颗粒药物组成：石菖蒲、远志、益智仁、胆南星、陈皮、半夏、羌活、石决明、礞石等。主要功效：涤痰止惊，补脑安神。取小儿安神补脑颗粒用蒸馏水完全溶解，将上清液调整为含生药50mg·mL-1，调pH值为7.4，高压灭菌后放置于4℃冰箱保存备用。SOD、GSH-Px和MDA试剂盒购买自南京建成生物工程研究所。Nrf2、HO-1、NQO-1及内参GAPDH引物均由由上海生工生物技术服务有限公司合成。

1.2 细胞株 PC12细胞购自中国科学院上海细胞库。

2 方法

2.1 PC12细胞的培养 PC12细胞置于DMEM高糖型培养基进行培养(培养基含1% L-谷氨酰胺，1%青链霉素，10%胎牛血清)，低分化PC12细胞半贴壁，3天换液1次。细胞培养至对数生长其可进行传代，0.05%的胰酶消化液消化细胞1-2min，加入等量含血清的培养基终止消化，收取含细胞的培养液于15mL离心管以1500 r·min-1离心5min，弃尽含胰酶的培养液，细胞以1∶3-1∶5比例进行传代。以细胞密度在(1-2)×105/mL左右接种于的常规塑料培养瓶中。培养24小时后换液，待细胞状态较好，进入对数生长期开始后续实验。

2.2 分组 实验分为(1)正常对照组。(2)6-OHDA应激组：给予终浓度为120 μmol·L-1的6-OHDA，作用24 h。(3)6-OHDA+小儿安神补脑颗粒实验组：分别给予终浓度为0.1、0.4、1.6、6.4mg·L-1的小儿安神补脑颗粒提取液，24h后给予终浓度为120 μmol·L-1的6-OHDA，作用24h。

2.3 MTT实验 按上述实验分组作用24h后，每孔加入浓度为5mg·mL-1的MTT，继续培养4h后吸去上清液，每孔加入100 μL的二甲基亚砜，37℃孵育1h后，酶标仪测定570nm处的吸光值。

2.4 SOD和MDA检测 收集细胞后制成细胞悬液，3000 r·min-1离心10 min，移去上清，PBS清洗后用含EDTA和TtitonX-100的PBS缓冲液进行裂解，3000 r·min-1离心15min，收集上清液，按照SOD和MDA试剂盒说明书进行测定。

2.5 RT-PCR检测 采用Trizol试剂裂解细胞。吸取裂解液于1.5mL离心管中，室温放置5-10min。接着加入0.2mL三氯甲烷，剧烈震荡15s，室温放置3min。之后12000r·min-1离心10min。吸取上清水相转移至干净的离心管中，加入等体积异丙醇，混匀，室温放置20min。12000 r·min-1离心10min，弃上清。底部出现的白色沉淀即RNA。加入1mL 75% 乙醇洗涤沉淀。12000 r·min-1离心3min，弃上清。室温干燥5-10min。加入30-50μL RNase-free ddH2O，充分溶解RNA后将溶液置于-80℃保存。按照荧光定量试剂盒测定Nrf2、HO-1、NQO-1及内参GAPDH表达量。

3 结果

3.1 小儿安神补脑颗粒对6-OHDA诱导PC12细胞增殖的影响 6-OHDA应激组细胞存活率显著低于正常组(P<0.01)。0.4 mg·L-1、1.6 mg·L-1、6.4 mg·L-1小儿安神补脑颗粒提取液处理后，细胞存活率较6-OHDA应激组显著提高(P<0.05；P<0.01；P<0.01)。见表1。

表1 小儿安神补脑颗粒对PC12细胞增殖的影响±s，n=8)

注：与正常组比较，##P<0.01；与6-OHDA应激组比较，*P<0.05，**P<0.01。

3.2 小儿安神补脑颗粒对6-OHDA诱导PC12细胞SOD、GSH-Px和MDA的影响 6-OHDA应激组细胞SOD和GSH-Px活性较正常组显著降低(P<0.01；P<0.01)，MDA释放较正常组显著增加(P<0.01)。0.4 mg·L-1、1.6 mg·L-1、6.4 mg·L-1小儿安神补脑颗粒提取液处理后，SOD和GSH-Px活性较6-OHDA应激组显著提高(P<0.05或P<0.01)，MDA释放较6-OHDA应激组显著降低(P<0.05；P<0.01；P<0.01)。见表2。

表2 小儿安神补脑颗粒对PC12细胞SOD、GSH-Px和MDA活性的影响

注：与正常组比较，##P<0.01；与6-OHDA应激组比较，*P<0.05，**P<0.01。

3.3 小儿安神补脑颗粒对6-OHDA诱导PC12细胞Nrf2、HO-1和NQO-1的影响 6-OHDA应激组细胞Nrf2、HO-1和NQO-1表达较正常组显著降低(P<0.05；P<0.05；P<0.05)。小儿安神补脑颗粒提取液处理后，Nrf2、HO-1和NQO-1表达较6-OHDA应激组显著提高(P<0.05或P<0.01)。见表3。

表3 小儿安神补脑颗粒对PC12细胞Nrf2、HO-1和NQO-1表达的影响

注：与正常组比较，#P<0.05；与6-OHDA应激组比较，*P<0.05，**P<0.01。

4 讨论

中医将神经系统疾病定义为“生理性肾虚”，补肾从古至今都被认为是防治神经系统疾病的重要治法[3]。中医理论认为“肾藏精，主骨生髓，髓通于脑，脑为髓海”。因此脑髓是否充足和肾之盛衰具有紧密的联系。肾旺盛则脑髓充足，肾衰亏虚则脑髓缺乏，从而导致神经元产生病变，诱发神经系统疾病。我院根据中医理论及多年临床实践，以补肾益脑、平抑肝阳、祛风化痰、镇静止惊为治制成以石菖蒲、远志、益智仁、胆南星、陈皮、半夏为主的小儿安神补脑颗粒，对小儿多发性抽动症疗效良好。

氧化应激是指体内氧化与抗氧化作用失衡，倾向于氧化，导致蛋白酶分泌增加，产生大量氧化中间产物[4]。氧化应激是由自由基在体内产生的一种负面作用，并被认为是导致神经系统疾病的一个重要因素[5]。氧化应激情况下，SOD和GSH-Px等抗氧化物酶活性下降，导致众多的氧自由基得不到及时清除，形成羟自由基，从而加重了氧化反应：羟自由基继而引发花生四烯酸的过氧化，生成大量的MDA，引起细胞增殖的下降[6]。本研究中小儿安神补脑颗粒可以拮抗6-OHDA诱导PC12细胞抗氧化酶SOD、GSH-Px活性表达下降，降低MDA的释放，维持PC12细胞的正常增殖，表明小儿安神补脑颗粒促进细胞增殖的作用可能与其增加抗氧化酶的活性，减少脂质的释放相关。

越来越多的研究表明氧化应激在神经系统疾病的发病机理和进展中发挥重要作用。因此，基于抗氧化应激的神经保护治疗是一种对神经系统疾病常见的治疗方案[7]。增强抗氧化可以赋予机体保护作用，可以降低神经系统疾病的发病危险。其中，上调依赖于ARE信号通路的内源性保护系统是提高机体防御氧化应激的一个重要方法。

Nrf2是一种基本的亮氨酸拉链转录因子，这种因子可以驱动所涉及的各种基因的转录产物(羟基自由基或MDA，蛋白质等)以及氧自由基[8]。因此，转录激活Nrf2的细胞可能参与保护应激所致的氧化损伤。此外，Nrf2是HO-1蛋白的和ARE通路激活的重要调节因子[9]。在正常生理环境下，Nrf2绑定到Keap1上[10]。当氧化应激时增加时，Nrf2从Keap1处释放并迅速移位到核，它与ARE结合导致抗氧化基因的转录的增加，激活诸如HO-1和NQO-1的抗氧化蛋白[11]。本实验中小儿安神补脑颗粒对6-OHDA诱导PC12细胞Nrf2、HO-1和NQO-1表达下降的缺陷表现出拮抗作用，表明其作用机制可能与小儿安神补脑颗粒促进Nrf2基因表达，进而提高抗氧化蛋白表达水平，减轻氧化应激损伤有关。

总而言之，我们的研究结果表明小儿安神补脑颗粒对6-OHDA诱导的PC12细胞发挥抗氧化应激作用与Nrf2-ARE信号通路的激活相关，这可能有助于延伸小儿安神补脑颗粒对氧化应激相关的神经系统疾病的使用。

[1]Modafferi S，Stornelli M，Chiarotti F，et al.Sleep，anxiety and psychiatric symptoms in children with Tourette syndrome and tic disorders[J].Eur J Paediatr Neurol，2016，20(5)：696-703.

[2]邱静宇， 刘 岩.小儿安神补脑颗粒治疗小儿多发性抽动症60例临床研究 [J].中医儿科杂志，2010，6(1)：33-36.

[3]沈自尹.从肾本质研究到证本质研究的思考与实践——中西医结合研究推动了更高层次的中医与西医互补 [J].上海中医药杂志，2000，34(4)：4-7.

[4]Kensler TW，Wakabayashi N， Biswal S.Cell survival responses to environmental stresses via the Keap1-Nrf2-ARE pathway[J].Annu Rev Pharmacol Toxicol，2007，47：89-116.

[5]Brown GC，Neher JJ.Inflammatory neurodegeneration and mechanisms of microglial killing of neurons[J].Mol Neurobiol， 2010，41(2-3)：242-247.

[6]Butterfield DA，Reed T，Sultana R.Roles of 3-nitrotyrosine- and 4-hydroxynonenal-modified brain proteins in the progression and pathogenesis of Alzheimer's disease[J].Free Radic Res，2011，45(1)：59-72.

[7]Nguyen T，Sherratt PJ，Pickett CB.Regulatory mechanisms controlling gene expression mediated by the antioxidant response element[J].Annu Rev Pharmacol Toxicol，2003，43：233-260.

[8]Li W，Yu SW，Kong AN.Nrf2 possesses a redox-sensitive nuclear exporting signal in the Neh5 transactivation domain[J].J Biol Chem，2006，281(37)：27251-27263.

[9]van Muiswinkel FL，Kuiperij HB.The Nrf2-ARE signalling pathway： promising drug target to combat oxidative stress in neurodegenerative disorders[J].Curr Drug Targets CNS Neurol Disord，2005，4(3)：267-281.

[10]Calkins MJ，Johnson DA，Townsend JA，et al.The Nrf2/ARE pathway as a potential therapeutic target in neurodegenerative disease[J].Antioxid Redox Signal，2009，11(3)：497-508.

[11]Itoh K，Tong KI，Yamamoto M.Molecular mechanism activating Nrf2-Keap1 pathway in regulation of adaptive response to electrophiles[J].Free Radic Biol Med，2004，36(10)：1208-1213

广东省深圳市科技研发资金(No.JCYJ 20150401163247216)

高厚明，男，副主任中药师。主要研究方向：中药鉴定、中药制剂、中药炮制等。

广东省深圳市中医院(518033)