雷公藤单萜合酶基因TwMS的克隆及蛋白表达分析

胡添源　苏平　张逸风　关红雨　周家伟　童宇茹　高伟　黄璐琦

[摘要] 该研究克隆得到1条雷公藤单萜合酶基因TwMS。其完整开放阅读框为1 797 bp，编码579个氨基酸，相对分子质量为69.75 kDa、理论等电点为5.37。生物信息学分析表明，TwMS具有单萜合酶的特征结构域，属于萜类合酶TPSb亚家族。实时荧光定量PCR检测显示，经茉莉酸甲酯（MeJA）诱导后，TwMS的相对表达量显著上调，并在24 h达到最高。此外，该研究在大肠杆菌BL21（DE3）中成功表达TwMS蛋白，为进一步研究该基因的功能奠定了基础。

[关键词] 雷公藤； 单萜合酶； 生物信息学分析； 基因表达分析； 蛋白表达

Cloning and protein expression analysis of monoterpene synthase gene TwMS in Tripterygium wilfordii

HU Tianyuan1， SU Ping2， ZHANG Yifeng1，2， GUAN Hongyu 1，2， ZHOU Jiawei1 ，

TONG Yuru1，2， GAO Wei1*， HUANG Luqi2

（1.Key Laboratory of Collateral Diseases， School of Traditional Chinese Medicine， Capital Medical University，

Beijing 100069， China；

2.State Key Laboratory of Daodi Herbs， National Resource Center for Chinese Materia Medica， Chinese

Academy of Chinese Medical Sciences， Beijing 100700， China）

[Abstract] In this study， we cloned a monoterpene synthases， TwMS from Tripterygium wilfordii suspension cells. TwMS gene contained a 1 797 bp open reading frame （ORF）， encoding a polypeptide of 579 amino acids， which deduced isoelectric point （pI） was 6.10 and the calculated molecular weight was 69.75 kDa. Bioinformation analysis showed that the sequence of TwMS was consistent with the feature of monoterpene synthases. Differential expression analysis revealed that the relative expression level of TwMS increased significantly after being induced by methyl jasmonate （MeJA）. The highest expression level occurred at 24 h. TwMS protein was successfully expressed in Escherichia coli BL21 （DE3）， which laid the foundation for identifying the function of T. wilfordii monoterpene synthases.

[Key words] Tripterygium wilfordii； monoterpene synthases； bioinformatics analysis； mRNA expression analysis； protein expression

中藥雷公藤Tripterygium wilfordii Hook. f.来源于卫矛科植物雷公藤的根或根的木质部，具有祛风除湿、通络止痛、活血消肿，杀虫解毒等功效。现代研究表明，雷公藤的药用活性成分萜类物质具有显著的抗炎、抗肿瘤、调节免疫等药理活性[1]，其主要活性成分包括二萜类成分雷公藤甲素和三萜类成分雷公藤红素等。其中雷公藤甲素可有效抑制肿瘤细胞生长，对胰腺癌的治疗效果显著[23]，此外，雷公藤甲素还具有神经营养活性，是治疗帕金森和老年痴呆等疾病的重要活性分子[45]。雷公藤红素除了具有神经保护作用和抗遗传性疾病等作用外，近年来还被报导是一种瘦素增敏剂，可以起到减肥的作用[6]。

单萜化合物是由2个异戊二烯结构单元组成的链状或环状化合物，广泛存在于植物挥发油和树脂中[7]。 单萜化合物多具有较强的香气和生物活性，在植物种群竞争、吸引昆虫传粉、防御植食性动物和控制病虫害发生等方面发挥着重要作用[810]。植物单萜由质体内的4磷酸2甲基赤藓糖 （2CmethylDerythritol4phosphate，MEP）途径合成，其前体物质为牻牛儿基焦磷酸（geranyl diphosphate，GPP）。单萜合酶 （monoterpenesynthases，monoTPS）是单萜生物合成的关键酶，单萜合酶基因的表达是植物生长发育过程中所必须的，具有明显的时空表达规律，其基因家族的不同成员往往在组织或器官的特定发育阶段表达，以合成植物通讯和生物防御所需的化感物质[1112]。单萜合酶基因的表达对环境的影响极为敏感，生物胁迫等外在压力可激活单萜合酶基因表达生成相应的单萜化合物，以对付食草动物、病虫害和病原菌等，很多单萜是植物防御系统的重要组成部分[10，13]，对植物的生长发育具有重要意义。

本研究首次克隆得到1条雷公藤的单萜合酶基因，并对其进行了生物信息学分析、茉莉酸甲酯（MeJA）诱导表达分析，以及IPTG 诱导蛋白表达分析等研究，为深入研究雷公藤单萜合酶基因功能以及对雷公藤植物生长发育的调控机制奠定了基础。

1 材料

1.1 雷公藤悬浮细胞

实验所用材料来源于本实验室继代保存的悬浮细胞。培养方法：在含有 0.5 mg·L-1 2，4D （2，4二氯苯氧乙酸） +0.1 mg·L-1 KT （激动素） + 0.5 mg·L-1 IBA （吲哚丁酸） 的MS 液体培养基中，于25 ℃，120 r·min-1黑暗条件下振荡培养。

1.2 菌株

实验中使用的 Escherichia coli trans 5α及E.coli BL21（DE3）购自北京全式金生物技术有限公司。

1.3 试剂及仪器

2×EasyTaq PCR SuperMix、pEASYT3 Cloning Kit 购自北京全式金生物技术有限公司；RNA 纯化试剂盒、琼脂糖凝胶 DNA回收试剂盒、质粒小提试剂盒、Fast Quant RT Kit （With gDNase） 购自天根生化科技（北京）有限公司； KAPA SYBR FAST Universal 2×qPCR MasterMix 购自 KAPA Biosystems 公司；Dnase I，Phusion HF PCR Master Mix，BamHⅠ 限制性内切酶，PstⅠ 限制性内切酶及 T4 DNA 连接酶购自NEB（北京）有限公司； IPTG 为 Sigma 品牌，购自泰科兰博生物科技有限公司；其他化学试剂为国产分析纯。PCR 扩增仪型号为 ABIverity；实时定量 PCR 仪型号为 ABI 7300 系统；蛋白电泳仪型号为BIORAD Mini PROTEAN Tetra System；蛋白扫描仪型号为 UMAX PowerLOOK 21OOXLUSB；引物合成及测序服务由北京睿博兴科生物技术有限公司完成。

2 方法

2.1 雷公藤总RNA提取

取培养 10 d的雷公藤悬浮细胞，加入 MeJA诱导子，使之终浓度为 50 μmol·L-1。分别于诱导后 0，4，12，48，72 h 后取材，液氮速冻后置于-80 ℃ 冰箱保存。利用 CTAB 法提取雷公藤悬浮细胞总 RNA，并用 DNase （NEB） 和 RNA 纯化试剂盒去除基因组污染，将纯化的 RNA用液氮速冻后置于-80 ℃ 冰箱保存。

2.2 雷公藤单萜合酶基因克隆与测序

参考雷公藤悬浮细胞转录组数据结合NCBI （http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/） BLAST，获得雷公藤单萜合酶TwMS基因序列和开放阅读框（open reading frame，ORF），设计cDNA克隆引物（表1）。利用FastQuant RT Kit （With gDNase）将纯化得到的雷公藤悬浮细胞总RNA反转录成cDNA，将各时间点的cDNA取出少量混合，作为单萜合酶全长基因克隆的模板。根据 Phusion HF PCR Master Mix 说明书配制PCR体系：cDNA 2 μL，2×Phusion HF PCR Master Mix 25 μL，正反向引物各2.5 μL （10 μmol·L-1），ddH2O 补足到50 μL。反应程序： 98 ℃ 30 s； 98 ℃ 10 s，55 ℃ 15 s，72 ℃ 30 s，重复 35 个循环；72 ℃ 5min。 将 PCR产物切胶回收后连接 pEASYT3 载体，转化至大肠杆菌 trans5α克隆感受态细胞中，通过菌液PCR挑选阳性克隆进行测序验证。

2.3 TwMS基因序列的生物信息学分析

将测序得到序列通过InterPro在线软件（http：// www.ebi.ac.uk /Tools/InterProScan）进行结构域分析，PRABIGERLAND（https：//npsaprabi.ibcp.fr/）进行二级结构预测，TargetP1.1 server （http：//www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/）进行信号肽分析，ExPAS ProtParam tool（http：//web.expasy.org/protparam/）预测蛋白相对分子质量和理论等电点，TRMHMM server v2.0 （http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM2.0/）进行跨膜域分析，Psort（http：//psort.hgc.jp/）及Wolfpsort（http：//wolfpsort.org/）分析亚细胞定位，SWISSMODEL（http：//swissmodel.expasy.org/） 进行二级结构分析和结构域的三维同源建模。根据NCBI BLAST结果下载同源序列，分别使用DNAMAN软件和MEGA 5.0软件进行多重序列比对和系统进化树的构建。

2.4 TwMS基因的表达分析

以反转录得到的MeJA 诱导不同时间的cDNA为模板，选取βactin 作为看家基因，检测雷公藤悬浮細胞中单萜合酶TwMS基因表达量的变化，设计实时荧光定量引物（表2）。反应体系如下：2×SYBR green Mix 10 μL，ROX 校正染料 0.4 μL，正反向引各 0.4 μL （10 μmol·L-1），ddH2O补足至20 μL。反应程序：95 ℃ 3 min；95 ℃ 3 s，60 ℃ 30 s，40个循环。每个循环后采集荧光信号，65～95 ℃ 做溶解曲线分析。反应结束后分析扩增曲线和溶解曲线。每个样品做技术重复3次，并通过2-ΔΔCT法[14]分析TwMS基因的相对表达量。

2.5 TwMS 的蛋白表达分析

2.5.1 TwMS 表达载体构建 选择重组蛋白表达载体pMALc2X，对载体和基因序列的限制性酶切位点进行分析，选取BamH Ⅰ 和 Pst Ⅰ作为载体构建的连接位点。在雷公藤单萜合酶基因TwMS的ORF两端设计添加限制性酶切位点的引物（表3），使用NEB Phusion HF PCR Master Mix进行PCR扩增，产物经切胶回收后，将回收得到已添加酶切位点的目的片段与载体分别进行双酶切，反应体系：Cutsmart buffer 5 μL，BamH Ⅰ 1 μL，Pst Ⅰ 1 μL，载体或片段5 μL，ddH2O补足至50 μL。反应条件为37 ℃，1 h。反应结束后将酶切产物进行切胶纯化，回收产物测浓度后按照NEB T4 DNA 连接酶说明书配制反应体系，并于16 ℃，连接过夜。将连接产物转化至大肠杆菌 trans5α克隆感受态细胞中，涂布在含有100 mg·L-1Amp的LB固体培养基上过夜培养，选取单克隆进行菌液PCR验证，并将阳性结果送公司测序验证。将测序结果正确的菌液扩大培养，保菌、提取质粒，得到的重组质粒即为构建成功的pMALc2XTwMS。

2.5.2 IPTG诱导蛋白表达 将重组质粒pMALc2XTwMS与空载体pMALc2X分别转化到大肠杆菌 BL21（DE3）表达感受态细胞中，挑取阳性单克隆于2 mL LB+100 mg·L-1Amp的液体培养基中，37 ℃ 250 r·min-1培养至A600为 0.6～1.0，取1 mL离心收集菌体，弃上清，用新的培养基重悬，转移至50 mL 的LB+100 mg·L-1Amp液体培养基中，37 ℃ 250 r·min-1摇到A600约 0.8，加入异丙基硫代半乳糖苷（isopropylbetaDthiogalactopyranoside，IPTG）至终浓度 1 mmol·L-1，20 ℃，200 r·min-1诱导12 h。将诱导完的菌液4 ℃，3 000 r·min-1离心20 min收集菌体，用新制的TrisHCl 缓冲液（50 mmol·L-1 Tris/HCl （pH 7.5），500 mmol·L-1 KCl，1 mmol·L-1 MnCl2，5 mmol·L-1 dithiothreitol，0.05% NaHSO3，10% glycerol）清洗2次，最后用5 mL TrisHCl 缓冲液重悬菌体。将重悬菌液置于冰中，超声破碎5 min（功率30%，超声5 s，暂停5 s），重复破碎1次后4 ℃，12 000 r·min-1离心 30 min，分离上清与沉淀，取上清再离心20 min，再次取上清，即为蛋白粗提物。

以含有空载体pMALc2X的大肠杆菌BL21（DE3）表达的蛋白粗提物为对照，与上述含有重组质粒大肠杆菌BL21（DE3）表达的蛋白粗提物上清共同进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺（SDSPAGE）凝胶电泳检测。

3 结果与分析

3.1 雷公藤TwMS全长 cDNA 的获得

设计特异性引物以雷公藤悬浮细胞cDNA为模板进行PCR扩增，产物经琼脂糖凝胶电泳检测，在1 800 bp附近有明亮单一的条带（图1），与预期目的条带大小一致。测序结果表明，TwMS的ORF大小为1 797 bp，编码579个氨基酸。

3.2 同源性比对及系统进化分析

将得到序列在NCBI上进行 BLAST，发现TwMS与其他植物的单萜合酶具有较高的同源性，与毛果杨Populus trichocarpa、葡萄Vitis vinifera、冬青栎Quercus ilex、黑杨Populus nigra、蓖麻Ricinus communis等植物单萜合酶的相似度均大于50%。通过Editseq软件将TwMS序列翻译成氨基酸序列，利用DNAMAN软件进行多重序列比对。比对结果显示， TwMS基因含有多个萜类合酶基因的高度保守结构域，包括富含天冬氨酸的底物结合基序DDxxD，N末端精氨酸富集基序RRx8W，C末端NSE/DTE基序以及DDxxD上游35个氨基酸处的高度保守域RxR基序（图2），符合被子植物单萜合酶序列特征[15]。

將TwMS与其他15个不同来源的单萜合酶氨基酸序列进行比对，通过软件 MEGA 5.0相邻连接法构建系统进化树（图3）。在萜类合酶7个亚家族（TPSag）中，单萜合酶分布于b，d，f，g 4个亚家族[1516]。裸子植物单萜合酶归属于TPSd亚家族，均包含一个RRx8W基序，谱系分化小；被子植物单萜合酶进化较快，分化较大，其中TPSg 亚家族单萜合酶缺少RRx8W基序，催化产物形成非环状、易挥发单萜[17]；大多数被子植物单萜合酶属于TPSb 亚家族，包含1个RRx8W基序；而TPSf亚家族是比较古老的分枝，主要成员包括仙女扇单萜合酶和拟南芥单萜合酶TPS04。进化树分析表明，雷公藤单萜合酶TwMS与被子植物黑杨P. nigra亲缘关系最近，归属于被子植物单萜合酶TPSb亚家族，与TPSf亚家族亲缘关系较远。

3.3 理化性质与 3 D 结构预测

TwMS蛋白的相对分子质量为69.75 kDa、理论等电点为5.37，为亲水性蛋白。信号肽分析显示无信号肽，跨膜域分析结果表明其为非膜蛋白，无分泌蛋白。亚细胞定位预测结果显示TwMS可能定位在内质网或质膜上。结构域分析表明，TwMS在62～270 aa 处含有萜环化酶/异戊烯基转移酶结构域，65～245 aa处编码N末端结构域，276～540 aa处含有1个金属结合结构域。TwMS蛋白的二级结构预测结果显示：无规则卷曲和α螺旋结构是其主要结构原件，无规则卷曲占49.41%，α螺旋结构占39.36%，剩余11.22%是长链结构。蛋白三维结构以4Slimonene synthase 2ong.1.A [18]为同源建模模板，建模范围为 56～596位氨基酸残基，序列同源性为44.80%（图4）。

3.4 MeJA 誘导TwMS基因表达分析

利用MeJA对雷公藤悬浮细胞进行诱导，利用实时荧光定量 PCR 检测以及 2-ΔΔCt 分析对TwMS基因进行相对定量表达分析表明，雷公藤单萜合酶基因TwMS对MeJA的诱导非常敏感，诱导后12 h，MeJA 处理组中基因的表达量上升到0 h的670倍，并于24 h达到最高诱导水平，处理组基因表达水平是同期对照组的1 172.3倍，240 h时TwMS基因的表达恢复至正常水平。

3.5 IPTG 诱导 TwMS蛋白表达分析

TwMS蛋白诱导表达的SDSPAGE 扫描结果表明，在 IPTG 诱导大肠杆菌BL21（DE3）表达后，含有pMALc2X空载质粒的菌株在 42 kDa 处表达了MBP 标签蛋白，含有重组质粒pMALc2XTwMS的菌株在约112 kDa 处有蛋白条带，而空载体菌株在相同的位置无蛋白表达，说明雷公藤单萜合酶基因PtTPS.terpene synthase. Populus trichocarpa （AII32476）；Vvter1.（-）alphaterpineol synthase. Vitis vinifera （Q6PWU2）；Vvter2.（-）alphaterpineol synthase V. vinifera （NP001268216）；QiMYR. Myrcene synthase. Quercus ilex （Q93X23.1）；PnTPS.monoterpene synthase. P. nigra （AHY21666）；红色标识表示特征结构域。

4 讨论

单萜合酶催化GPP合成种类繁多、功能各异的单萜类化合物，在植物种群竞争、吸引昆虫传粉、生物防御等方面发挥着极其重要的作用。本研究首次在重要药用植物雷公藤中克隆得到单萜合酶，并通过生物信息学分析等手段对该基因进行研究，发现该基因编码蛋白具有典型的单萜合酶结构域，属于萜类合酶TPSb亚家族，但由于单萜合酶基因家族

基因种类繁多，通过序列比对、蛋白结构预测等手段较难推测该单萜合酶的具体催化产物，因此命名为Tripterygium wilfordii monoterpene synthases，简称TwMS。研究发现，TwMS基因对MeJA的诱导异常敏感，表达量可上调至1 000倍以上，而MeJA等诱导子诱导基因表达水平的上调可有效提高雷公藤萜类成分的产量[19]，由此推测，TwMS基因很可能参与了雷公藤萜类产物的代谢。单萜合酶基因会因环境刺激、生物胁迫等原因迅速表达，由MeJA诱导的敏感程度来看，TwMS基因很有可能在雷公藤的应激或生物防御过程中发挥作用。此外，本研究成功在大肠杆菌中对TwMS基因进行了异源表达，为进一步研究该基因的功能奠定了基础。

[参考文献]

[1] Zhou Z L， Yang Y X， Ding J， et al. Triptolide： structural modifications， structureactivity relationships， bioactivities， clinical development and mechanisms[J]. Nat Prod Rep， 2012， 29（4）：457.

[2] Titov D V， Gilman B， He Q L， et al. XPB， a subunit of TFIIH， is a target of the natural product triptolide[J]. Nat Chem Biol， 2011， 7（3）：182.

[3] Chugh R， Sangwan V， Patil S P， et al. A preclinical evaluation of minnelide as a therapeutic agent against pancreatic cancer[J]. Sci Transl Med， 2012， 4（156）：4085.

[4] Lu L， Li F， Wang X. Novel antiinflammatory and neuroprotective agents for Parkinson′s disease[J]. Cns Neurol DisordDr， 2010， 9（9）：232.

[5] Wang X， Liang X B， Li F Q， et al. Therapeutic strategies for Parkinson′s disease： the ancient meets the futuretraditional Chinese herbal medicine， electroacupuncture， gene therapy and stem cells[J]. Neurochem Res， 2008， 33（10）：1956.

[6] Junli L， Jaemin L， Mario Andres S H， et al. Treatment of obesity with celastrol[J]. Cell， 2015， 161（5）：999.

[7] Bohlmann J， MeyerGauen G， Croteau R. Plant terpenoid synthases： molecular biology and phylogenetic analysis[J]. Proc Natl Acad Sci USA， 1998， 95（8）：4126.

[8] Lippert D， Chowrira S， Ralph S G， et al. Conifer defense against insects： proteome analysis of Sitka spruce （Picea sitchensis） bark induced by mechanical wounding or feeding by white pine weevils （Pissodes strobi）[J]. Proteomics， 2007， 7（2）：248.

[9] Holopainen J K. Multiple functions of inducible plant volatiles[J]. Trends Plant Sci， 2004， 9（11）：529

[10] Pichersky E， Gershenzon J. The formation and function of plant volatiles： perfumes for pollinator attraction and defense[J]. Curr Opin Plant Biol， 2002， 5（3）：237.

[11] Chen F， Tholl D， D'Auria J C， et al. Biosynthesis and emission of terpenoid volatiles from arabidopsis flowers[J]. Plant Cell， 2003， 15（2）：481.

[12] Chen F， Ro D K， Petri J， et al. Characterization of a rootspecific Arabidopsis terpene synthase responsible for the formation of the volatile monoterpene 1，8cineole[J]. Plant Physiol， 2004， 135（4）：1956.

[13] Steele C L， Katoh S， Bohlmann J， et al. Regulation of oleoresinosis in grand fir （Abies grandis）. Differential transcriptional control of monoterpene， sesquiterpene， and diterpene synthase genes in response to wounding[J]. Plant Physiol， 1998， 116（4）：1497.

[14] Livak K J， Schmittgen T D. Analysis of relative gene expression data using realtime quantitative PCR and the 2-ΔΔCT， method[J]. Methods， 2001， 25（4）：402.

[15] Bohlmann J， MeyerGauen G， Croteau R. Plant terpenoid synthases： molecular biology and phylogenetic analysis[J]. Proc Natl Acad Sci USA， 1998， 95（8）：4126.

[16] Natalia Dudareva， Diane Martin， Christine M Kish， et al. （E）βocimene and myrcene synthase genes of floral scent biosynthesis in snapdragon： function and expression of three terpene synthase genes of a new terpene synthase subfamily[J]. Plant Cell， 2003， 15（5）：1227.

[17] Aharoni A，Giri A P，Verstappen F W， et al. Gain and loss of fruit flavour compounds produced by wild and cultivated strawberry species[J]. Plant Cell， 2004， 16（11）：3110.

[18] Hyatt D C， Youn B， Zhao Y， et al. Structure of limonene synthase， a simple model for terpenoid cyclase catalysis[J]. Proc Natl Acad Sci USA， 2007， 104（13）：5360.

[19] 張萌， 苏平， 刘雨佳，等. 雷公藤牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶基因全长cDNA的获得及生物信息学分析[J]. 中国中药杂志， 2015， 40（6）：1066.

[责任编辑 吕冬梅]