冬青油促进蛇床子素和桅子苷透皮吸收的研究

高学成　仝燕

[摘要] 该文拟研究冬青油的体外经皮促渗效果及其作用机制。选择蛇床子素和桅子苷作为亲脂性和亲水性模型药物，利用体外透皮试验测定冬青油的经皮促透效果；采用傅利叶变换红外光谱技术研究冬青油对大鼠皮肤角质层分子结构的影响，并利用扫描电镜直观观察冬青油对大鼠皮肤表皮的影响，探讨其经皮促透机制。结果表明，当冬青油达到一定应用浓度后对蛇床子素和桅子苷均具良好经皮促透效果，但对蛇床子素的促透效果更佳，接近于常用经典促透剂月桂氮酮；红外光谱和扫描电镜研究显示，冬青油主要作用于皮肤角质层脂质，降低角质层致密排列，从而降低皮肤屏障作用。由此可知，冬青油作为促透剂可有效增加亲脂性和亲水性药物的透皮吸收，且对亲脂性药物促透效果更佳，这与其作用于皮肤角质层脂质而改变皮肤表层致密结构有关。

[关键词] 冬青油； 促透剂； 透皮吸收； 经皮促透机制

Effect of wintergreen oil on in vitro transdermal permeation of

osthole and geniposide

GAO Xuecheng1， TONG Yan2*

（1.Guang′anmen Hospital， China Academy of China Medical Sciences， Beijing 100053， China；

2. Institute of Chinese Materia Medica， China Academy of Chinese Medical Sciences， Beijing 100700， China）

[Abstract] The aim of this study was to investigate the transdermal penetration enhancement effect of wintergreen oil and its action mechanisms. The in vitro transdermal tests were carried out to study the transdermal penetration enhancement effect of wintergreen oil by using osthole and geniposide as the lipophilic and hydriphilic model drugs. Fouriertransform infrared spectroscopy was used to investigate the effect of wintergreen oil on the molecular structure of rat stratum corneum， and the scanning electron microscope was employed to observe the change of rat skin surface after treatment by the oil. The wintergreen oil at proper concentrations could effectively promote the transdermal permeation of osthole and geniposide， and exhibited better penetrationenhancing activity for the lipophilic osthole， close to the commonly used classical penetration enhancer azone. The infrared spectroscopy study and scanning electron microscope showed that wintergreen oil mainly acted on the stratum corneum lipids， reduced dense stratum corneum， and reduced the skin barrier function. Thus， the wintergreen oil could effectively facilitate the transdermal absorption of the lipophilic and hydrophilic drugs， resulting from the lowed skin barrier function.

[Key words] wintergreen oil； penetration enhancer； transdermal absorption； transdermal penetration enhancing mechanisms

冬青油，又稱白珠木油，为冬青叶中提取的一种无色或浅黄色植物精油，其主要成分是水杨酸甲酯。冬青油在中药外用制剂中应用广泛，《中国药典》2015年版中所收载多种中药外用制剂中均含冬青油，如麝香镇痛膏、跌打镇痛膏、活血止痛膏、伤疖膏等[1]，其在这些中药外治处方多作为引药。文献研究显示，植物精油成分除其自身药理活性外，在中药外用制剂中多发挥类似经皮促透剂作用，具“引药”功效[23]，从而促进外治处方中有效成分的透皮吸收。

但是，目前尚无研究证明冬青油是否具有类似经皮促透剂的作用及其相关作用机制。虽然中药成分组成复杂，但影响药物透皮吸收的主要因素在于药物的亲脂性和相对分子质量，其中，相对分子质量通常要求不超过500，因此，本研究分别选择蛇床子素和桅子苷2种具亲脂性和亲水性的中药有效成分为模型药物，采用体外透皮试验测定冬青油作为促透剂的经皮促透特征。同时，利用傅利叶变换红外光谱技术和扫描电镜研究冬青油对皮肤结构的影响，探讨其经皮促透机制，从而揭示冬青油在中药外用制剂处方中的“引药”作用，并为从中药中开发天然经皮促透剂提供数据支持。

1 材料

TK24BL型体外透皮扩散试验仪（上海锴凯科技贸易有限公司）；Agilent 1260型高效液相色谱仪（美国安捷伦科技有限公司）；BS110型电子分析天平（德国Sartourius科学仪器有限公司）；Quata250型电子扫描电镜仪（捷克FEI公司）；Nexus型全反射傅利叶变换红外光谱仪（美国Thermo公司）。

冬青油（吉安盛大香料油有限公司，批号20160702）；蛇床子素（上海源叶生物科技有限公司，批号20151003，纯度≥98%）；桅子苷（上海源叶生物科技有限公司，批号20160301，纯度≥98%）；月桂氮酮（国药集团化学试剂有限公司，批号F20110831）；泊洛沙姆188（德国巴斯夫公司，批号WPW1603B）；胰蛋白酶（北京索莱宝科技有限公司，批号112B1220）；乙腈、甲醇为色谱纯，其他试剂均为分析纯。

健康雄性SD大鼠，体重（250±10）g，由北京斯贝福实验动物技术有限公司提供，动物许可证号SCXK（京）20110004。

2 方法

2.1 蛇床子素HPLC含量测定方法 色谱条件 Diamonsil ODS C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；柱温30 ℃；流动相为85%甲醇，流速1 mL·min-1；检测波长323 nm；进样量10 μL。蛇床子素的相对保留时间约为9.4 min，透皮接收液中其他成分对其含量测定无干扰，见图1。

精密称取蛇床子素适量，用体外透皮试验的接收液配成质量浓度为0.1，0.5，1.0，5.0，10，20，50 mg·L-1的系列对照品样品，采用上述方法测定，进样量为10 μL。所测得峰面积（Y）与蛇床子素质量浓度（X）具有良好的线性关系，回归方程为Y=23 892.82X-704.19 （r=0.999 9）。低、中、高3个浓度（0.1，5.0，50 mg·L-1）的日内日间精密度RSD均小于2.0%，方法回收率在99.00%～101.0%，表明该方法准确、可靠，可用于蛇床子素在体外透皮试验的含量测定。

2.2 桅子苷HPLC含量测定方法 色谱条件 Diamonsil ODS C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；柱温30 ℃；流动相为20%乙腈，等度洗脱；流速1 mL·min-1；检测波长240 nm；进样量10 μL。桅子苷的相对保留时间约为6.3 min，透皮接收液中其他成分对其含量测定无干扰，见图2。

精密称取桅子苷适量，用体外透皮试验的接收液配成质量浓度为0.01，0.1，1.0，5.0，10，20 mg·L-1的系列对照品样品，采用上述方法测定，进样量为10 μL。所测得峰面积（Y）与桅子苷质量浓度（X）具有良好的线性关系，回归方程为Y=5 067.19X-359.49 （r=0.997 5）。低、中、高3个质量浓度（0.1，5.0，20 mg·L-1）的日内日间精密度RSD均小于3.0%，方法回收率在98.00%～102.0%，表明该方法准确、可靠，可用于桅子苷在体外透皮试验的含量测定。

2.3 体外透皮试验 透皮试验前，取SD大鼠断颈处死，递净腹部体毛后小心剥离，用剪刀和棉球去除

皮下脂肪层后用生理盐水中洗净。将制备好的皮肤固定在Fran Z扩散池间（接收液体积为7 mL，有效透过面积为1.77 cm2），角质层面朝上，选择0.01 mol·L-1磷酸缓冲盐溶液作为桅子苷的接收介质；为保证蛇床子素在体外透皮过程中的漏槽状态，用含3%泊洛沙姆188的磷酸缓冲盐作为接收介质[4]，水浴温度设置为32 ℃，搅拌子转速200 r·min-1，加入药物溶液前平衡30 min，并排出透皮池内气泡；选择丙二醇水（80∶20）作为介质溶解不同浓度冬青油和药物后加入到供给池中，在1，2，4，6，8，10，12，22，24 h分别从接收池内取样1 mL，然后补加相同体积等温新鲜接收介质，所取样品用0.45 μm滤膜过滤后进行含量测定，同时，按如下公式计算药物的单位面积累积透过量Q（μg·cm-2）。

Q=VCn+n-1i=1Ci/A

其中，V为接收池体积（即7 mL）；Cn和Ci分别为第n次和第i次取样时接收液中药物浓度，A为透皮池有效扩散面积。然后用累积透过量对时间回归作图，其中直线部分斜率即为药物透皮稳态流速，直线部分反向延长线与X轴的交点即为滞后时间。同时，将只含溶解介质作为对照组，并以其稳态流速作为参比计算各处理组的促透比率。

2.4 傅利叶变换红外光谱（FTIR）研究 按照2.3项下方法制备离体大鼠皮肤，将大鼠腹皮置于1.0%胰蛋白酶溶液中，37 ℃条件下处理约7 h[5]，然后小心分离皮肤表层角质层，并用蒸馏水清洗干净后置真空干燥箱内脱水干燥。取适宜大小角质层置于不同浓度冬青油溶液中，其中，选择透皮试验中丙二醇水（80∶20）作为冬青油溶解介质，并以其作为对照组，在32 ℃条件下浸泡24 h后，用蒸馏水清洗干燥后，进行傅利叶变换红外光谱测定，其中红外测定参数为扫描范围700～3 500 cm-1，分辩率2 cm-1。各处理组分别重复测定5次。

2.5 扫描电镜观察 按照2.3项下方法制备大鼠离体腹皮样品，将其放置在不同浓度冬青油溶液中处理24 h，然后将各处理组皮肤洗净后进行固定漂洗后固定脱水干燥镀膜处理，采用扫描电镜观察各處理组中皮肤角质层表面的变化情况。

3 结果

3.1 冬青油的体外透皮促透效果 为考察冬青油的经皮促透特征，并结合冬青油在中药外用制剂中的常用浓度范围，分别配制3个浓度梯度，即0.1%，1.0%，3.0%，研究不同应用浓度条件下的冬青油经皮促透特征的变化。同时，月桂氮酮作为外用制剂中常用经典促透剂，且0.1 mol·L-1（约3%）月桂氮酮是应用中最为常用的浓度[6]，因此，选择3%月桂氮酮在此研究中作为阳性对照组，进一步对比分析冬青油的经皮促透特征。

不同浓度冬青油对亲脂性药物蛇床子素和亲水性药物桅子苷的体外经皮渗透曲线和相关经皮渗透参数分别见图3和表1。随着应用浓度的增加，冬青油对蛇床子素和桅子苷的经皮促透比率均逐渐增加，表明冬青油的经皮促透作用具浓度依赖性关系。0.5%，1%，3%冬青油对脂溶性药物蛇床子素的促透比率分别为1.84，4.87，11.52，而对具亲水性药物桅子苷的促透比率分别为1.79，3.36，5.93，表明冬青油对亲脂性药物的经皮促透作用更为显著，而对亲水性药物的促透效果相对较差。同时，与同浓度的月桂氮酮相比，冬青油对桅子苷的经皮促透效果表现相对较差，但是，对蛇床子素的促透效果与月桂氮酮较为接近，提示一定应用浓度条件下的冬青油对亲脂性药物的经皮促透效果可与月桂氮酮较为接近。

3.2 傅利叶变换红外光谱学研究 典型的大鼠皮肤角质层脂质的对称和不对称碳氢振动吸收峰可在红外吸收光谱中2 850，2 920 cm-1处显现[7]，角蛋白的酰胺Ⅰ和酰胺Ⅱ吸收峰在1 700～1 600 cm-1和1 600～1 500 cm-1

和峰面积体现出来，其中峰位移则提示其相应成分结构产生一定改变，而峰面积的改变则表明其对应成分含量的变化。因此，可利用红外光谱研究冬青油对角质层中脂质和角蛋白成分中次级结构的变化情况。

冬青油作用下大鼠角质层中脂质和角蛋白相应成分对应峰位置和峰面积的变化情况见图4，表2。与对照组相比，0.5%，1.0%，3.0%冬青油作用下，对角质层脂质中不对称碳氢振动峰（νasCH2）和对称碳氢振动峰（νsCH2）的峰位移分别为0.53，2.76，4.63和0.39，1.12，2.39，而对2个角蛋白酰胺吸收峰没有明显影响。同时，在冬青油作用下，角质层质脂不对称和对称碳氢振动吸收峰有降低趋势，且对对称碳氢振动峰影响更为明显；而对角蛋白酰胺吸收峰面积影响不显著，该结果表明冬青油主要作用于角质层脂质，在一定程度上改变其分子结构和降低脂质成分，降低了角质层脂质所形成的致密排列结构，从而有利于药物的透皮吸收。

3.3 扫描电镜观察 不同浓度冬青油对大鼠皮肤表面的微观变化见图5。正常皮肤表面呈褶皱状排列，褶皱突起表面相对平滑，当冬青油作用于皮肤后，皮肤表面相对平滑的褶皱突起部分开始出现鳞片状，且随冬青油浓度增加而加剧，其中，当冬青油浓度达3%后，皮肤表面褶皱突纹理已表现相对平坦，鳞片状现象表现更为明显。该结果更直观地展示了冬青油对皮肤表面角质层的微观变化，进一步证实冬青油对皮肤表面角质层致密结构的改变，从而导致皮肤屏障作用的降低。

4 讨论

本研究选择丙二醇水（80∶20）作为药物和冬青油的溶解介质，一方面是考察到亲脂性、亲水性模型药物以及冬青油的溶解性差别，需选择具较宽溶解范围的介质，而丙二醇水（80∶20）既能溶解亲脂性的冬青油和蛇床子素，又能溶解亲水性的桅子苷[9]；另一方面，文献报道该溶剂对皮肤结构影响小，不会改变皮肤的正常分子结构[10]。

体外透皮试验结果显示，当冬青油达到一定浓度后，对亲脂性和亲水性药物均具促透作用，但对亲脂性药物的经皮促透效果明显更好。与外用制剂中常用的经典促透剂月桂氮酮相比，虽然冬青油对亲水性药物促透效果表现较差，但对亲脂性药的促透效果则已接近于同浓度的月桂氮酮，提示在含亲脂性有效成分的中药外用制剂中可选择冬青油作为促透剂，以增加有效成分的透皮吸收。

皮肤角质层作为药物经皮吸收的主要屏障，主要由角质细胞和细胞间脂质组成，形成类似“砖泥”的致密结构[11]。其中，相对于富含角蛋白的角质细胞，细胞间脂质形成脂质双分子层在药物经皮吸收中起着主要作用[12]。冬青油经皮促透作用机制的研究表明，冬青油利用其自身的脂溶性特征，不仅可抽提部分角质层脂质，还在一定程度上破坏了角质层脂质结构，改变表层角质层的致密排列，降低皮肤屏障作用，从而有利于药物的经皮转运。

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[责任编辑 孔晶晶]