蒙花苷与木犀草素联用对离体血管的舒张作用及其机制研究

杨耀　陈波　梁凯伦　苏洁　陈素红　吕圭源

[摘要] 为研究蒙花苷与木犀草素联用对SD大鼠离体血管环的舒张作用及其作用机制。采用离体血管环张力实验观察蒙花苷单用（7.5×10-6 g·mL-1）、木犀草素单用（7.5×10-6 g·mL-1）、蒙花苷与木犀草素联用（1∶4）对去甲肾上腺素引起的SD大鼠完整、去内皮、LNAME及吲哚美辛预处理胸主动脉收缩的影响；Western blot检测胸主动脉pAkt，peNOS等蛋白水平。实验结果显示，蒙花苷与木犀草素联用对完整、去内皮及LNAME预处理的血管环舒张率高于两者单用；且两者联用能显著促进血管中pAkt，peNOS蛋白表达。实验结果说明蒙花苷与木犀草素联用能有效舒张血管，其机制可能是通过激活PI3K/Akt/NO信号通路，增强eNOS活性，从而增加NO的合成与释放，达到舒张血管的作用。

[关键词] 蒙花苷； 木犀草素； 联用； 血管舒张； 机制； 高血压

Relaxation effect of buddleoside combined with luteolin on isolated

vessels in vivo and its mechanism

YANG Yao1， CHEN Bo1， LIANG Kailun1， SU Jie1， CHEN Suhong2*， LV Guiyuan1*

（1.Zhejiang Chinese Medical University， Hangzhou 310053， China；

2.Zhejiang University of Technology， Hangzhou 310053， China）

[Abstract] To study the relaxation effect of buddleoside combined with luteolin on aortic rings in SD rats and its mechanism. The effect of buddleoside alone（7.5×10-6g·mL-1）， luteolin alone（7.5×10-6g·mL-1） and the combination of buddleoside and luteolin（1∶4） on norepinephrineinduced contractility of complete， endotheliumdenuded， and LNAME and indomethacinpretreated thoracic aorta in SD rats were observed in the in vitro ring tension test. Western blot was used to detect pAkt and peNOS protein expressions in the thoracic aorta. The experimental results showed that buddleoside combined with luteolin could significantly increase the relaxation rate of blood vessels and endothelium and LNAMEpretreated vascular rings compared with the two single administrations. And buddleoside combined with luteolin could also significantly increase pAkt and peNOS protein expressions.The results suggested that the combination of buddleoside and luteolin could effectively relax the blood vessel， and the mechanism may be to increase the synthesis and release of NO and reach the role of relaxing blood vessel by activating PI3K/Akt/NO signaling pathway and enhancing the activity of eNOS.

[Key words] buddleoside； luteolin； combination； vasorelaxation； mechanism； hypertension

高血壓病是以动脉血压增高为主要临床表现，是严重危害人类健康的常见病；绝大多数高血压患者均有不同程度的血管内皮功能障碍，而血管内皮结构和功能的改变又会促进高血压的发展[1]。高血压的发病机制与神经内分泌免疫网络密切相关，是整体调节共同作用的结果；中医药具有多成分、多靶点优势，能有效改善血管内皮功能，舒张血管达到降压的作用[2]。

野菊花是菊科植物菊花Chrysanthemum indicum的干燥头状花序，是一种常用的治疗高血压中药[3]；植物化学研究表明，菊花富含木犀草素和蒙花苷等多种黄酮类化合物，且木犀草素和蒙花苷被认为是其最重要的降压活性成分[4]。木犀草素（luteolin，LUT）是一种常见的黄酮类化合物，存在于许多类型的植物中，且已被用于中国传统医学治疗多种疾病，如高血压、炎症性疾病和癌症等[58]。蒙花苷（buddleoside，BUD）是中药野菊花中主要的活性化合物，具有抗炎、镇痛、发汗、降血压、抗应激、焦虑、解热等活性[9]。已有研究表明木犀草素血管舒张作用的结构活性关系[10]；而蒙花苷对于血管损伤的保护研究甚少。本课题组前期研究表明，蒙花苷与木犀草素联用对于自发性高血压模型大鼠（SHR）的高血压治疗有明显的联用增效作用，能显著降低SHR大鼠的收缩压与舒张压，降低SHR大鼠血清中内皮素（endothelin，ET）的释放和增加血清中一氧化氮（nitric oxide，NO）的水平[11]，提示其作用机制可能与舒张血管相关。因此，本文采用离体大鼠胸主动脉环模型，观察研究木犀草素、蒙花苷及其联用的舒张血管作用及其机制。

1 材料

1.1 动物 SD大鼠24只，雄性，体重220～400 g，由浙江省实验动物中心提供，许可证号SCXK（浙）20140001。

1.2 试剂 蒙花苷（76.01%，实验室自制）；木犀草素（98%，南京泽朗）；重酒石酸去甲肾上腺素注射液（NE，批号130803，上海禾丰制药有限公司）；氯化乙酰胆碱（Ach，≥98.0%，上海信帆生物科技有限公司）；戊巴比妥钠（Sigma分装，批号WS20130112，上海西唐科技有限公司）；吲哚美辛（indomethacin）、左旋硝基精氨酸甲酯（Lnitro arginine methyl ester，LNAME）均购自美国Sigma公司。RIPA蛋白裂解液、ECL化学发光液、BCA蛋白浓度测定试剂盒（碧云天生物技术研究所）；磷酸化丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶抗体（pAkt，CST公司），磷酸化一氧化氮合酶抗体（peNOS，CST公司），GAPDH抗体（Santa Cruz公司）；氯化钠（NaCl）、氯化钙（CaCl2）、氯化钾（KCl）、磷酸二氢钠（NaH2PO4）、硫酸镁（MgSO4）、碳酸氢钠（NaHCO3）以及葡萄糖（Glucose）均为国产分析纯化学试剂。

1.3 仪器 离体血管灌流实验系统（上海奥尔科特生物科技有限公司）；张力换能器（上海奥尔科特生物科技有限公司）；ALCMPA2000m生物信号采集处理系统（上海奥尔科特生物科技有限公司）；电热恒温水槽（美国Thermo Fisher Scientific公司）；Powerwave340酶标仪（美国BIOTEK）；MICROCL17微量离心机（美国Thermo）；化学发光成像仪（MiniChemiⅡ，北京赛智创业科技有限公司）。

2 方法

2.1 KrebsHenseleit solution液（KH液）配制 A液：MgSO41.2 mmol·L-1；B液：CaCl21.8 mmol·L-1，NaCl 118.1 mmol·L-1；C液：KCl 4.7 mmol·L-1，NaHCO325 mmol·L-1，KH2PO41.63 mmol·L-1；glucose 10.0 mmol·L-1。取A，B母液各50 mL，C母液100 mL，葡萄糖2 g，加去离子水定容到1 000 mL，用pH计和HCl调至pH 7.4，现配现用（新鲜配制，每只大鼠约需500 mL）。

2.2 离体主动脉环的制备 大鼠腹腔注射3%戊巴比妥钠50 mg·kg-1麻醉，剪开胸腔，迅速游离胸主动脉，置于KH液中漂洗。小心剪除血管周围的脂肪和结缔组织，将主动脉剪成3～5 mm的血管环。根据实验需要，采用机械法，用棉签摩擦血管环内表面去除内皮细胞，将部分血管环制备成去内皮的模型。

2.3 离体主动脉环固定 将血管环悬挂于经37 ℃预热，容量为10 mL的浴槽内，一端固定，一端通过张力换能器连接生物信号采集系统，在持续通和95% O25%CO2混合气体的状态下，逐渐调节其基础张力至2 g，并在37 ℃下稳定60 min，其间每15 min换液1次。用1 μmol·L-1NE收缩血管环达峰值，加入浓度为10 μmol·L-1Ach，通过血管舒张的程度检验血管內皮完整性。以1 μmol·L-1NE诱发最大收缩幅度为100%，以加入舒张药物后的血管张力变化幅度与NE诱发最大收缩幅度之间的比率反映血管张力的变化。

2.4 BUD，LUT和两者联用对血管环的舒张作用 取内皮完整或去内皮的血管环，分为对照组、BUD单用组（7.5×10-6 g·mL-1）、LUT单用组（7.5×10-6 g·mL-1），BUD+LUT联用组（1∶4）；各组药物预先孵育15 min后，加入1 μmol·L-1NE收缩血管环，观察不同受试药对血管的舒张作用；对照组以等量KH液代替受试药加入。实验结束后，将各组血管环迅速取下，保存于液氮中。

2.5 BUD，LUT和两者联用对不同拮抗剂预处理的血管环的舒张功能的影响 取内皮完整血管环，血管环稳定后，分为对照组、BUD单用组（7.5×10-6 g·mL-1）、LUT单用组（7.5×10-6 g·mL-1），BUD+LUT联用组（1∶4）；分别以 0.1 mmol·L-1LNAME预处理血管环15 min或10 μmol·L-1吲哚美辛预处理血管环20 min；再加入相应的药物与血管环共孵育15 min，最后加入1 μmol·L-1NE收缩血管环，观察不同受试药对血管的舒张作用；对照组以等量KH液代替受试药加入。实验结束后，将各组血管环迅速取下，保存于液氮中。

2.6 BUD，LUT和两者联用保护离体大鼠血管环pAkt，peNOS蛋白表达 取上述各实验保存的离体大鼠血管环组织，经液氮研磨后，加入RIPA蛋白裂解液，提取组织蛋白，然后用BCA蛋白测定试剂盒检测蛋白浓度。蛋白经8%～10%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDSPAGE）分离后，转移到聚偏氟乙烯（PVDF）膜上，然后用5%的脱脂奶粉溶液，在摇床上室温封闭2 h，加入不同一抗：pAkt（1∶1 000），peNOS（1∶1 000），GAPDH（1∶1 000），4 ℃孵育过夜，PBST洗涤3次，加入相应二抗，室温下孵育1 h，PBST洗涤3次。反应信号经ECL化学发光液检测，结果MiniChemi Ⅱ凝胶成像仪采集图像，分析结果。

2.7 统计处理 实验数据用±s表示，采用SPSS 16.0软件进行统计学分析，统计学方法为单因素方差分析（Oneway ANOVA）并做多重比较（LSD法），P<0.05为有统计学意义。

3 结果

3.1 BUD，LUT和两者联用对内皮完整和去内皮血管环的舒张作用 在内皮完整血管环上，BUD和LUT单用及两者联用均可显著舒张NE引起的血管收缩，且联用舒张率更大（P<0.05或P<0.01）；在去内皮血管环上，除BUD单用外，LUT单用及两者联用同样地均可显著舒张NE引起的血管收缩，且联用舒张率更大（P<0.01）；与内皮完整血管环相比，在去内皮血管环上，BUD，LUT单用及两者联用的舒张率均减小，但仅BUD单用引起的舒张率具有统计学差异（P<0.01），见图1。

3.2 BUD，LUT和两者联用对LNAME预处理血管环舒张作用的影响 LNAME预处理血管环后，LUT单用和两者联用能显著舒张NE引起的血管收缩，且联用舒张率更大（P<0.01）；与未经LNAME预处理的血管环相比，BUD，LUT和两者联用对LNAME预处理的血管环的舒张率均显著降低（P<0.01），见图2。

3.3 BUD，LUT和两者联用对吲哚美辛预处理血管环舒张作用的影响 吲哚美辛预处理血管环后，LUT单用和两者联用能显著舒张NE引起的血管收缩，且联用舒张率更大（P<0.01）；与未经吲哚美辛预处理的血管环相比，BUD，LUT单用和两者联用对吲哚美辛预处理的血管环的舒张率无统计学差异，见图3。

3.4 BUD，LUT和两者联用对离体大鼠血管环pAkt，peNOS蛋白表达的影响 BUD，LUT单用及两者联用能显著增加完整血管环和去内皮血管环组织中的pAkt，peNOS蛋白水平，且联用效果更好；LNAME预处理的血管环后，血管环组织中pAkt，peNOS蛋白水平显著降低，BUD，LUT单用及两者联用能不同程度增加LNAME预处理血管环组织中pAkt，peNOS蛋白水平的表达，且联用效果更好。而BUD，LUT单用及两者联用对经吲哚美辛预处理的血管环组织中pAkt，peNOS蛋白水平的表达无明显影响，见图4。

4 讨论

近年来，通过动物实验及体外细胞研究表明，多种中药及有效成分可通过降血脂、抗氧化损伤、调节内皮细胞活性物质分泌、抗细胞凋亡等达到保护血管内皮功能的目的[12]。中药治疗血管内皮功能障碍相关性疾病具有获得方便、价格低廉、容易被人们接受的独特优势。虽然中药抗血管内皮损伤的部分作用机制研究已有报道，但中药复方、提取物的多靶点作用途径仍需重视，大量研究仅涉及内皮细胞的各种分泌因子在中药药理作用下的变化，却未能阐明其调节的环节和方式。因此，研究具有血管内皮细胞保护作用的中药及中药复方药物对心血管疾病的防治研究具有重要意义。

高血压、动脉粥样硬化、冠心病、心绞痛等多种心血管疾病状态下的血管内皮功能障碍的主要原因有eNOS合成/活性的降低，NO生成的减少；血管活性氧（reactive oxygen species，ROS）的过量产生，O2-与NO反应生成ONOO-，导致NO的生物利用度降低；以及脂质过氧化和抗氧化能力的降低[13]。ET和NO平衡失调是内皮功能障碍的主要原因之一。NO是一种高度活跃的自由基，并具有舒张血管的功能，它以左旋精氨酸（LArg）为底物，由一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，NOS）的催化生成[14]。血管内皮上的NO/内皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）系统在调节血管舒缩功能中发挥着重要作用[15]。PI3K/Akt信号通路的活化能促进内皮细胞的存活和血管生成[16]。蛋白激酶Akt是一种调节细胞存活、生长和糖代谢的多功能调节器；就其心血管功能，Akt激活下游血管生长因子血管内皮生长因子（VEGF）和促血管新生蛋白因子使内皮细胞存活和确保血管生成[1718]。除此之外，Akt还具有磷酸化eNOS丝氨酸1179或1177位點的能力，诱导内皮细胞NO的生成，从而控制血管舒缩功能[19]。

木犀草素具有广泛的生物活性和药理作用[2023]。已有研究表明木犀草素保护大鼠心脏组织缺血再灌注损伤通过抑制诱导型一氧化氮合酶表达，降低NO的产生，然后阻止NO与超氧阴离子自由基的作用，从而防止氧化损伤[24]。另有研究发现木犀草素保护缺血再灌注诱导的心肌细胞损伤是通过改善心肌收缩功能，抑制氧化应激，以及激活PI3K/Akt信号通路[25]。且本实验室前期研究表明，蒙花苷与木犀草素联用对于自发性高血压模型大鼠的高血压治疗有明显的联用增效作用，能降低SHR大鼠血浆中ET的释放和增加NO水平[11]。

本实验采用离体血管环模型，研究发现BUD与LUT联用能舒张NE引起的血管收缩，对完整及去内皮的离体血管环的舒张率均高于BUD和LUT单用组，且去内皮血管环的舒张率低于完整血管环；经LNAME预处理，抑制血管环内皮eNOS的活性后，血管环的舒张率均显著低于完整血管环，BUD与LUT联用能显著升高LNAME预处理后的血管环的舒张率，且显著高于BUD和LUT的单用；而经吲哚美辛预处理，抑制血管环内皮环氧合酶2的活性后，血管环的舒张率与完整血管环的舒张率相比，无明显差异；且BUD，LUT单用及联用引起的血管环舒张率与完整血管环的舒张率相比，无明显差异。Western blot结果显示经去内皮、LNAME预处理后，peNOS的表达明显低于完整血管环；经吲哚美辛预处理后，peNOS的表达与完整血管环相比无明显差异。BUD与LUT联用均能促进各组血管环中pAkt，peNOS蛋白水平的表达，并明显优于BUD及LUT单用。上述结果提示BUD与LUT联用舒张血管的方式是内皮依赖性舒张作用，且可能是通过增强血管内皮eNOS的活性，从而舒张NE引起的血管收缩。

综上所述，BUD与LUT联用舒张血管的作用机制可能是通过PI3K/Akt/NO信号通路，促进eNOS磷酸化而激活eNOS的活性，从而增加内皮NO的合成与释放，达到舒张血管的作用。此外，该研究对于解释中药配方的强大优势，相对于单味药的应用，多味药联合应用产生的更可靠和更强大的效果具有重要的意义。

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[责任编辑 张宁宁]