基于超高效液相色谱飞行时间质谱技术的肺炎支原体感染小鼠血清代谢组学研究

魏文峰　褚衍涛　刘烨　霍金海　王伟明

[摘要] 采用超高效液相色谱与串联四级杆飞行时间质谱（UPLCQTOFMS）联用技术的代谢组学方法，分析肺炎支原体（MP）感染小鼠血清内源性代谢物的变化，筛选出与肺炎支原体肺炎（MPP）相关的潜在生物标记物，分析代谢通路，探讨MPP的致病机制。采用MP滴鼻感染的方法建立小鼠MPP模型，肺组织病理切片、IgM和支原体核酸的含量测定结果显示造模成功。利用UPLCQTOFMS方法分析MP感染小鼠的血清代谢轮廓，利用主成分分析（PCA）和正交偏最小二乘判别分析（OPLSDA）方法进行数据处理。结果显示MP感染模型小鼠的血清代谢谱与正常小鼠有显著差别，经数据库检索、质谱信息匹配，筛选出包括鸟氨酸、皮质醇、维生素A、色氨酸等47种生物标志物，涉及视黄醇代谢、精氨酸与脯氨酸代谢、甾类激素合成等17条代谢通路。该文建立了基于UPLCQTOFMS技术的MP感染小鼠血清代谢组学研究方法，从整体水平反映了MP感染小鼠内源性小分子的代谢变化，为进一步在分子水平进行药物筛选与评价奠定了基础。

[关键词] 肺炎支原体； 代谢组学； 超高效液相色谱飞行时間质谱； 模式识别

Serum metabonomics in mice infected with mycoplasma

pneumoniae by UPLCQTOFMS

WEI Wenfeng， CHU Yantao， LIU Ye， HUO Jinhai， WANG Weiming*

（Heilongjiang Academy of Chinese Medical Sciences， Harbin 150036， China）

[Abstract] Ultra high performance liquid chromatography coupled with tandem quadrupole time of flight mass spectrometry（UPLCQTOFMS） was applied to metabonomics study in BALB/c mice infected with mycoplasma pneumoniae（MP） to analyze the changes in serum endogenous metabolites， identify potential biomarkers associated with mycoplasma pneumoniae pneumonia（MPP）， analyze the metabolic pathway and explore the pathogenic mechanism of MPP. The BALB/c mice were inoculated with MP by repeated intranasal infectious routes to establish MPP models， and the results of the lung tissue biopsy， IgM and mycoplasma nucleic acid content determination showed that the models of MP in BALB/c mice were successfully established. UPLCQTOFMS was used to analyze the serum metabolic profiling of BALB/c mice infected with MP， and then principal component analysis（PCA） was combined with orthogonal partial least squares discriminant analysis（OPLSDA） for data processing. The results showed that there were significant differences in serum metabolic profile between the MP infected mice and the normal mice. Fortyseven potential biomarkers such as ornithine， cortisol， vitamin A and tryptophan were screened out by database searching and MS information matching. These potential biomarkers related to 17 metabolic pathways including retinol metabolism， arginine and proline metabolism， steroid hormone synthesis and so on. The metabonomic research method for serum of mice infected with mycoplasma pneumoniae based on UPLCQTOFMS was established in this study. The metabolic changes of endogenous small molecules in mice infected with MP were reflected in the overall level， laying the foundation for the selection and evaluation of MPP drugs.

[Key words] mycoplasma pneumonia； metabolomics； ultraperformance liquid chromatography coupled with quadrupole timeofflight mass spectrometry； pattern recognition

肺炎支原体（mycoplasma pneumonia，MP）是引起呼吸道疾病和全身性病变的重要致病菌之一，可引起肺炎支原体肺炎（mycoplasma pneumoniae pneumonia，MPP）。它是学龄前儿童和青少年时期最常见的肺炎之一，发病率为19.6%～21.9%，呈逐年增加趋势[1]。小儿肺结构发育不完善，经过反复感染后，极易受损。MP主要通过飞沫传播，引起上呼吸道和肺部感染，同时引起脑炎、 心肌炎、 肝炎、 关节炎等肺外组织或器官的病变。临床表现多种多样，严重时出现暴发型肺炎，发展迅速，最终因呼吸衰竭而死亡[2]。

MPP临床检测主要利用病原体培养法和血清学检测确证。病原学检测结果阳性率低，病原体培养结果明显滞后，并且每种诊断都有其局限性，临床上常采用多种检测手段联合应用的方式，但是仍有高达40%～50%的社区获得性肺炎不能确定相关病原体，严重影响早期的抗菌药物选择[3]。代谢组学从整体观出发，以机体代谢物组变化为载体，以时空动态性和全局性观点，试图全面解析疾病对机体的影响[4]。代谢组学技术已经在实验动物模型评价中展现了其特色和优势[56]，但目前关于支原体肺炎代谢组学的研究尚未见报道。

本研究利用代谢组学研究方法，以MP感染小鼠血清为研究对象，采用UPLCQTOF 液质分析，并通过化学计量学模式识别的方法，发现潜在的生物标志物（potential biomaker）并鉴定，解析代谢通路。从代谢组学角度阐明MPP的致病机制，为其有效防治提供新理论，促进治疗MPP药物的筛选和开发。

1 材料

ACQUITYTM UPLC液相色谱仪（美国Waters公司）；Sciex 5600+型质谱仪（美国AB Sciex公司）；IKA MS3 digital涡旋振荡器（广州仪科实验室技术有限公司）；DH5000型电热恒温培养箱（上海一恒仪器有限公司）；LDZX75KB型立式蒸汽灭菌锅（上海申安医疗器械厂）；DLCJ1N型超净工作台（北京东联哈尔仪器制造有限公司）；ST16R型高速低温离心机（美国赛默飞世尔科技有限公司）。

肺炎支原体国际标准菌株FH（ATCC15531，美国菌种保藏中心）；PPLO培养基（碧迪医疗器械有限公司）；乙醚（分析纯，天津科密欧化学试剂有限公司）；核酸定量检测试剂盒（广州中山大学达安基因股份有限公司）；甲醇（色谱级，Merck公司）；乙腈（色谱级，Merck公司）；甲酸（色谱级，Thermo Scientific）；屈臣氏蒸馏水（广州屈臣氏食品饮料有限公司）。

BALB/c雄性小鼠20只，SPF级，体重（20±2）g，北京维通利华实验动物有限公司提供，许可证号SCXK（京）2012001。饲养于黑龙江中医药科学院动物实验中心，环境温度 （20±2） ℃，相对湿度 （50±20）%。

2 方法

2.1 支原体培养与造模方法 支原体培养参见文献[7]。小鼠支原体肺炎模型采用支原体滴鼻感染方法，将20只BALB/c小鼠随机分为空白组和模型组，每组10只，乙醚麻醉，模型组取MP培养液20 μL缓慢滴入BALB/c小鼠鼻孔内，每日1次，连续感染3 d。空白组给予无MP的培养液。

2.2 样品采集与预处理 小鼠于造模结束后24 h采集樣本，采集前禁食12 h，各组由眼眶取血，血液静置1 h后于3 000 r·min-1离心10 min取血清，-80 ℃冻存。取血后处死小鼠，剪取左肺组织10%甲醛固定，用以病理切片观察；剪取右肺组织用于支原体核酸定量检测。

HE 染色实验：取甲醛固定的肺组织，用乙醇梯度脱水，二甲苯透明2 次，放入石蜡内进行包埋。蜡块修好后固定于石蜡切片机上切片，将完全展开的蜡片贴附于清洁载玻片上，常规HE 染色，在显微镜下进行MP 特异性病变间质性肺炎的病理组织学检查。

血清IgMMP测定：取各组血清样品，同时设定对照孔和标准样品孔，每孔加入50 μL样品，50 μL IgM结合物，室温孵育1 h，洗去孔内液体，加入100 μL底物，室温孵育30 min，加入100 μL终止液，于450 nm下读取吸光度值。

支原体核酸含量测定：取肺组织100 mg加入100 μL纯水，匀浆，吸取20 μL，加入等量DNA提取液，100 ℃保温10 min，8 000 r·min-1离心5 min，取上清液2 μL用于测定，同时设立标准曲线样本、质控样本，测试方法参照试剂盒说明书设定相关程序。

代谢组学样本测定：每个样本取100 μL血清，加400 μL甲醇，涡旋30 s，4 ℃条件下13 000 r·min-1离心10 min，取上清液用于代谢组学分析。

2.3 色谱条件 Waters Acquity UPLC BEH C18 色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；流动相0.1%甲酸水（A）0.1%甲酸乙腈（B），梯度洗脱，0～3 min，95%～40%A，3～4 min，40%A，4～9 min，40%～0%A，流速0.3 mL·min-1； 柱温50 ℃；样品仓温度4 ℃；进样量3 μL；色谱仪流出液不分流直接注入质谱仪进行正负离子扫描检测。

2.4 质谱条件 采用ESI离子源，离子化模式为电喷雾正、负离子模式，正离子扫描模式参数：离子源电压5 500 V；离子源温度550 ℃；雾化气55 psi（1 psi=6.895 kPa）；辅助气55 psi；气帘气35 psi；去簇电压80 V；碰撞能量35 eV；碰撞能量扩展15 eV；TOFMS扫描范围80～1 500；Product Ion扫描范围50～1 500。扫描方式：IDA设置响应值超过100 cps的8个最高峰进行二级质谱扫描，并开启动态背景扣除（DBS）。Analyst TF 1.6 software采集工作站；采用AB Sciex公司的CDS质量校正系统在线校正。负离子扫描模式：离子源电压-4 500 V；去簇电压（DP）-80 V；碰撞能量（CE）-35 eV；其余参数同正离子扫描模式。

2.5 数据处理 将所有生物样本的UPLCMS数据导入MarKerview软件，进行峰匹配、峰对齐、峰提取和归一化处理，进而进行主成分分析（PCA）及正交偏最小二乘法判别分析（OPLSDA），并采用正交信号校正技术过滤变量信息，通过代谢轨迹变化趋势分析模型组与空白组的差异，确定主成分和潜在生物标志物（Marker）。利用QTOF测定各Marker的精确相对分子质量，对所筛查的具有显著性差异的代谢物进行分析，计算其可能的分子式。再通过分子式检索Human Metabolome Database（HMDB）数据库，结合文献和标准品确证的方式，鉴定潜在生物标志物的化学结构。通过检索代谢途径数据库KEGG和MetPA，结合相关文献、生物化学及分子生物学知识，探讨潜在生物标志物相关生物学意义。

3 结果

3.1 小鼠肺组织病理变化 小鼠肺组织病理切片评分系统由1 个0～26分的可数评分组成[8]，5 个分类评价系统由管腔周围浸润而致的细支气管和支气管数目、管腔周围浸润的程度、管腔内渗出的严重度、血管周围浸润的频度、实质性肺炎的严重度合并后记分，每张切片选择5 个视野评分。空白组支气管、肺泡、血管等无明显病变，上皮细胞状态良好，肺组织中未见炎性细胞浸润；模型组支气管中度改变，官腔有大量分泌物，肺泡上皮坏死，弥漫性细胞浸润，边缘模糊，病变面积较大，肺泡腔内伴以淋巴细胞为主的炎性细胞浸润，严重者伴有红细胞渗入（表1，图1）。

3.2 血清IgM与MP核酸定量 与空白组相比，模型组血清IgM含量极显著升高（P<0.01）（图2），MP核酸数量显著上升（P<0.01）（图3），显示模型复制成功。

3.3 小鼠血清代谢组学分析 采用UPLCMS进行血清样本的分离与数据采集，将所得数据导入MarkerView软件进行PCA无监督分析（图4），在正离子2个主成分（PC1：82.2；PC2：4.6）和负离子2个主成分（PC1：56.1；PC2：11.2）构建的得分图可直观看出，空白组与模型组有显著分开趋势。为进一步区分不同组别差异，对2组血清代谢物进行有监督的OPLSDA分析（图5），正离子模式的模型参数为R2=0.959 5，Q2=0.880 9，负离子模型参数为R2=0.986 2，Q2=0.961 4，参数显示所构建模型有效，可用于后续组间差异成分的寻找及分析。结合MarkerView软件中t检验包筛选在2组中有显著性差异（P<0.05）的离子，t检验得到的火山图及其结合Fold图且Fold Change>1.5倍，筛选出对分型贡献较大且具有显著性差异的离子作为潜在的生物标志物进行分析鉴定（图6）。

3.4 MPP潜在生物标志物鉴定 潜在标志物的鉴定方法为通过一级质谱信息确定相对分子量， 利用二级质谱信息获得其结构碎片信息。通过HMDB，KEGG，METLIN等多个数据库检索，共推断出47个生物标志物，并列举了各生物标志物在空白组和模型组中的表达水平。与空白组相比，模型组代谢物水平升高的有20种，降低的有27种（表2）。

3.5 代谢通路分析 应用MetPA网站构建分析代谢通路，并选择小鼠物种，将推断的47个代谢物的HMDB编号输入进行代谢通路分析（图7）。利用拓扑分析，代谢通路影响的临界值设置为0.01，大于这个值将选择作為潜在的关键代谢通路（表3）。与支原体肺炎相关的代谢通路共涉及视黄醇代谢、精氨酸和脯氨酸代谢、甾类激素合成、色氨酸代谢、嘌呤代谢等17个代谢途径。

3.6 生物标志物与生化病理指标的相关性分析 选取OPLSDA中Fold Change>2的差异变量化合物与IgM含量、MP含量及病理切片中病变面积总分进行相关性分析，找出代谢物与病理生化指标的相关性并列出相关系数（表4）。结果表明，5羟吲哚乙酸、2氨基辛酸、赖氨酸、L色氨酸与MP含量有极度相关性，D2羟谷氨酸、赖氨酸、L色氨酸、对甲酚与病理面积总分有极度相关性，D2羟谷氨酸、2氨基辛酸、赖氨酸与IgM含量极度相关。

4 讨论

经前期实验摸索，本研究从生化指标和肺组织病理指标判断，MPP模型动物造模成功，进一步利用代谢组学方法结合UPLCQTOFMS技术，研究MPP小鼠血清内源性代谢物的变化规律。本课题组已熟练掌握肺炎支原体培养、测定及滴鼻感染小鼠的造模方法[8]，经前期实验摸索确定了肺炎支原体感染小鼠的剂量。在UPLCQTOFMS测定中，每间隔5个样品进样1个QC样品，选取QC样品中不同保留时间段内响应值高的5个化合物质控分析，选取化合物的保留时间及峰面积的RSD均小于1.0%，保证此评价方法的可靠性。利用模式识别的数据处理方式初步判定47个生物标志物，发现其中对正常组和模型组区分贡献较大的代谢物涉及了17条代谢通路。

维生素A（VA）涉及到视黄醇代谢，对维持视觉并促进机体生长发育有重要作用，另外可以增强机体的免疫反应[9]。VA的缺乏可引起气管、支气管上皮细胞发育受阻，细胞脱落，气道上皮完整性遭到破坏。本研究中，模型组VA水平降低，提示MPP可引起VA水平下降，进而导致气道上皮完整性的破坏和机体免疫功能下降。

鸟氨酸和乙酰氨基丁酸涉及精氨酸和脯氨酸代谢，本研究中模型组小鼠的鸟氨酸水平降低，鸟氨酸转化作用增强，乙酰氨基丁酸水平降低，说明聚肽类进一步转化的作用下降，提示腐胺等聚肽类水平升高，直接或间接影响细胞的pH[10]。文献报道，在小鼠哮喘模型的肺组织中聚肽类水平有所增加。同时因为VA的缺乏，气道上皮的损伤和脱落，炎性细胞的浸润等，气道壁结构易发生改变，气道动力出现滞缓，在一定程度上导致了支原体肺炎患者的哮喘症状。

色氨酸涉及色氨酸代谢，体内氨基酸作为蛋白质合成原料及分解代谢产物，参与多种生理和病理过程，其水平的高低往往可以反映机体的代谢情况。色氨酸是人体必需氨基酸之一，在肝脏以外，色氨酸主要通过降解为犬尿氨酸进行代谢，该过程受吲哚胺2，3双加氧酶（IDO）影响，IDO是色氨酸犬尿氨酸转化途径的限速酶，炎症因子干扰素γ（IFNγ）是其诱导剂[11]。本研究中，模型组色氨酸水平降低，加速了色氨酸犬尿氨酸途径，提示机体炎症明显。

次黄嘌呤和尿酸涉及嘌呤代谢，嘌呤是动物基因结构的一部分，在机体中起着代谢调节、能量供应等重要作用。次黄嘌呤和尿酸是腺嘌呤和鸟嘌呤的代谢产物，其中，次黄嘌呤来自一磷酸腺苷的分解代谢，该过程受氧气含量影响较大，缺氧时，一磷酸腺苷会加速分解，导致次黄嘌呤含量在血中增加[12]。本研究中，模型组次黄嘌呤和尿酸含量升高，可能由于肺组织充血、水肿等，导致气管和支气管管壁增厚，管腔变得狭窄，进而影响通气，同时肺泡腔因为渗出阻碍气体交换，从而引起缺氧环境而致。

综上所述本研究采用UPLCQTOFMS技术结合模式识别数据分析手段，进行了小鼠支原体肺炎的血清代谢组学研究。共标识了47种生物标志物，并且呈现一定的上调或下调趋势，这些生物标志物涉及17条代谢通路，其中视黄醇代谢、精氨酸与脯氨酸代谢、甾类激素合成等代谢途径与肺组织损伤、炎症反应、免疫抑制有密切关联。本研究从整体水平反映了支原体肺炎内源性小分子的代谢变化，有助于MPP代谢网络的全面构建及疾病诊断，为抗MPP药物的选择与评价奠定了基础。

[参考文献]

[1] Se J P， Ki S P， Ah R K. Fulminant and futal multiple organ failure in a 12yearold boy with mycoplasma pneumoniae infection[J]. Allergy Asthma Immun， 2012，4（1）：55.

[2] 霍金海，褚衍涛，王伟明.代谢组学在肺炎中的应用研究进展[J].国际呼吸杂志，2015，35（18）：1424.

[3] Slupsky C M， Rankin K N， Fu H， et al. Pneumococcal pneumonia： potential for diagnosis through a urinary metabolic profile[J]. J Proteome Res， 2009，8（12）： 5550.

[4] Nicholson J K， Lindon J C， Holmes E. “Metabonomics” understanding the metabolic responses of living systems to pathophysiological stimuli via multivariate statistical analysis of biological NMR spectroscopic data[J]. Xenobiotica， 1999，29（11）：1181.

[5] 严蓓，阿基业，郝海平，等. 基于血浆和心肌内小分子的代谢组学方法评价心肌缺血大鼠模型[J].药学学报， 2013，48 （1）：104.

[6] 顾媛媛， 张丹丹， 冯程， 等. 基于UPLCQTOFMS技术的牛血清白蛋白诱导过敏反应的代谢组学研究[J].中国中药杂志，2016，41（21）：4029.

[7] Narita M. Pathogenesis of extrapulmonary manifestation of mycoplasma pneumonia infection with special reference to pneumonia[J]. J Infect Chemother， 2010，16（3）：162.

[8] 姚琳， 张俊威，王博， 等.芩百清肺浓缩丸对肺炎支原体感染大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞修复作用的研究[J]. 中国中药杂志， 2016， 41（8）：1493.

[9] Medeiros S R， PinheiroRosa N， Lemos L，et al.Vitamin A supplementation leads to increases in regulatory CD4+Foxp3+LAP+T cells in mice[J].Nutrition，2015，31（10）：1260.

[10] Benson R C， Hardy K A， Morris C R. Arginase and arginine dysregulation in asthma[J]. J Allergy（Cairo），2011，2011：736319.

[11] Schiffer L， Anderko S， Hobler A， et al. A recombinant CYP11B1 dependent Escherichia coli biocatalyst for selective cortisol production and optimization towards a preparative scale[J]. Microb Cell Fact，2015，14（1）：209.

[12] Laiakis E C， Morris G A， Fornace A J， et al. Metabolomic analysis in severe childhood pneumonia in the Gambia，West Africa：findings from a pilot study[J].PLoS ONE，2010，5（9）：e12655.

[責任编辑 曹阳阳]