三种蛋白酶酶解核桃饼粕的抗氧化活性研究

罗燕，和兴萍，李雪，赵声兰*

（云南中医学院中药学院，云南昆明650500）

三种蛋白酶酶解核桃饼粕的抗氧化活性研究

罗燕，和兴萍，李雪，赵声兰*

（云南中医学院中药学院，云南昆明650500）

该研究以核桃饼粕（WC）、石油醚脱脂核桃饼粕（PEWC）、石油醚及丙酮脱脂核桃饼粕（PEAWC）、核桃饼粕分离蛋白（WCP）、石油醚脱脂核桃饼粕分离蛋白（PEWCP）、石油醚及丙酮脱脂核桃饼粕分离蛋白（PEAWCP）为研究对象，分别采用碱性蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶超声水解，以抗氧化活性为评价指标，筛选最佳的蛋白酶及原料处理方法。结果表明，碱性蛋白酶水解PEWC对OH·、O2-·和DPPH·清除率最高，分别为18.74%、28.44%和79.96%；胰蛋白酶酶解PEWC的总还原力最大；胰蛋白酶水解PEWCP的OH·和DPPH·清除率最高，分别为21.44%和80.22%，但O2-·清除率较低；胃蛋白酶水解PEWCP的O2-·清除率最高，达30.23%；碱性蛋白酶酶解PEWCP的总还原力最大；核桃饼粕经石油醚脱脂后的酶解产物抗氧化活性最高，且以碱性蛋白酶为最佳水解酶。

核桃饼粕；核桃饼粕分离蛋白；蛋白酶；自由基清除率；抗氧化活性

LUO Yan,HE Xingping,LI Xue,ZHAO Shenglan*
(Faculty of Traditional Chinese Medicine,Yunnan University of Traditional Chinese Medicine,Kunming 650500,China)

核桃（Juglans reginLinn.）又名胡桃、羌桃，属胡桃科核桃属植物，是一种重要的木本油料作物，营养价值高[1]。冷榨核桃饼粕为核桃冷榨取油后的副产物[2]，蛋白质含量丰富，脱脂核桃饼粕中蛋白质含量高达53.89%[3]，含有包括8种人体必需氨基酸在内的18种氨基酸，是一种优质植物蛋白[4]。核桃饼粕蛋白分子结构复杂，相对分子质量较大，不利于生物体的消化和吸收[5-6]。酶解蛋白质是改善蛋白质特性的一种有效方法，核桃蛋白经酶解后利于消化和吸收，营养价值提高，且酶解生成具有保护神经、抑制血管紧张素转化酶及改善学习记忆等多种生物功能的活性肽[7-9]。

目前对核桃饼粕酶解的研究较少，核桃饼粕大多用于饲料，利用价值较低。对核桃蛋白的研究较多，核桃蛋白酶解产物抗氧化活性的研究主要集中在优化酶解条件[10-11]，通过酶解提高核桃蛋白的溶解性和抗氧化特性[12]。在酶解过程中，底物和酶的选择对于酶解物抗氧化活性的高低至关重要[13]。植物蛋白酶如木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶等酶解效率相对较低，且容易失活[14-15]；胃蛋白酶、胰蛋白酶和微生物来源的碱性蛋白酶均为内切酶，对核桃蛋白的酶解效果较好，可快速消化核桃蛋白质[16]。蛋白多肽的抗氧化活性受很多因素影响，且作用机制多样，单一检测体系往往很难全面反映其抗氧化能力，需采用多种体系来研究其作用效果[17-18]。本研究分别采用碱性蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶酶解经不同处理方式处理的核桃饼粕，测定酶解物的羟自由基、超氧阴离子自由基、DPPH自由基清除率和总还原力，分析不同种类蛋白酶对不同处理的核桃饼粕酶解物抗氧化活性的影响，筛选出最佳蛋白酶及原料处理方式，以期为利用核桃饼粕制备抗氧化活性肽和高效综合开发利用核桃饼粕奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

核桃饼粕：云南汇智源食品有限公司；碱性蛋白酶（酶活2×105U/g）：宝生物工程TaKaRa（大连）有限公司；胃蛋白酶（酶活为3 000 U/g）、胰蛋白酶（酶活为2.5×104U/g）：昆明鼎国生物技术有限公司；浓盐酸、氢氧化钠、硫酸亚铁、过氧化氢、水杨酸、焦性没食子酸、乙二胺四乙酸二钠（ethylene diamine tetraacetic acid-2Na，EDTA-2Na）、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠（均为分析纯）：天津市风船化学试剂科技有限公司；抗坏血酸（分析纯）：重庆创导化工有限公司；三羟基氨基甲烷（分析纯）：上海埃博商贸有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）：上海如吉生物科技发展有限公司；三氯乙酸（分析纯）：天津市大茂化学试剂厂；无水三氯化铁（分析纯）：上海泰坦科技股份有限公司；铁氰化钾（分析纯）：西安化学试剂厂。1.2仪器与设备

CH1015T超级恒温槽：上海精密仪器有限公司；L550/530离心机：长沙高新技术开发区湘仪离心机仪器有限公司；YH-A 30002电子天平：瑞安市英衡电器有限公司；CP214电子天平：奥豪斯仪器（上海）有限公司；UV mini 1240紫外可见分光光度计：日本岛津公司；SK7210HP超声波清洗器：上海科导超声仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 核桃饼粕及脱脂核桃饼粕的制备

核桃饼粕（walnut cake，WC）：将冷压榨制备核桃油后的核桃饼粕粉碎，过80目筛。

石油醚脱脂核桃饼粕（petroleum ether defatted walnut cake，PEWC）：以核桃饼粕为原料，石油醚（沸程60～90℃）为溶剂，料液比1∶10（g∶mL），50℃超声回流提取40 min，脱脂，静置15 min，分离并回收上层石油醚，下层核桃饼粕用石油醚再次脱脂后干燥，得PEWC。

石油醚及丙酮脱脂核桃饼粕（petroleumetherandacetone defatted walnut cake，PEAWC）[19]：以石油醚脱脂核桃饼粕为原料，丙酮为溶剂，料液比1∶12（g∶mL），50℃超声回流提取30 min，静置15 min，分离并回收上层丙酮，下层核桃饼粕干燥，得PEAWC。

1.3.2 核桃饼粕分离蛋白的制备[20]

分别称取100 g WC、PEWC、PEAWC于2 000 mL烧杯，加蒸馏水2 000 mL，搅拌混匀，用1 mol/L NaOH调节pH至9.0，混匀，50℃超声提取（超声功率250W）1 h，静置30 min，3000r/min离心20min，上清液用1mol/L盐酸调节pH至4.5，搅拌，静置30 min，3 000 r/min离心20 min，沉淀层加蒸馏水洗至中性，3 000 r/min离心20 min，冷冻干燥，得核桃饼粕分离蛋白（walnut cake protein，WCP）、石油醚脱脂核桃饼粕分离蛋白（petroleum ether defatted walnut cake protein，PEWCP）、石油醚及丙酮脱脂核桃饼粕分离蛋白（petroleum ether and acetone defatted walnut cake protein，PEAWCP）。

1.3.3 蛋白质含量的测定

按照GB/T5009.5—2016《食品安全国家标准食品中蛋白质的测定》中的分光光度法测定核桃饼粕蛋白含量，以氨氮标准溶液（0.1 g/L）制作标准曲线，以蛋白质含量（x）为横坐标，吸光度值（y）为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程y=0.006 2x-0.003 5，相关系数R2=0.998 8。根据标准曲线回归方程计算各样品的蛋白质含量。

1.3.4 核桃饼粕及核桃饼粕分离蛋白酶解物的制备[21]

选择碱性蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶进行水解，各蛋白酶的反应条件见表1。分别配制5%WC、PEWC、PEAWC、WCP、PEWCP、PEAWCP溶液，充分搅拌，90℃水浴15 min，调pH到蛋白酶的最适范围，加入适量蛋白酶，在各蛋白酶适宜条件下酶解2 h。酶解过程中，通过滴加1 mol/L NaOH溶液或1mol/L盐酸溶液保持各反应液的pH值。反应结束后，酶解液于100℃水浴灭酶15 min，冷却，调节pH值至7.0，4000r/min离心5min，上清液经冷冻干燥后即为酶解产物。

表1 各蛋白酶的最适反应条件Table 1 Optimum reaction conditions of protease

1.3.5 核桃饼粕及核桃饼粕分离蛋白酶解物体外抗氧化活性测定

（1）羟基自由基（OH·）清除率的测定[22]

在10mL试管中依次加入2mL9mmol/L硫酸亚铁溶液、2mL9mmol/L乙醇-水杨酸溶液，然后分别加入2mL1mg/mL的WC、PEWC、PEAWC、WCP、PEWCP、PEAWCP样品酶解液和2 mL 8.8 mmol/L H2O2，混匀，37℃水浴30 min，以蒸馏水调零，在波长510 nm处测定吸光度值A1；以2 mL蒸馏水代替H2O2，测定其吸光度值A2；以2 mL蒸馏水代替样品酶解液，测定其吸光度值A0。OH·清除率计算公式如下：

（2）超氧阴离子自由基（O2-·）清除率的测定[22]

分别取4.5 mL 50 mmol/L Tris-HCl缓冲液（25℃，pH 8.2）于18支10 mL试管中，分别加入1 mL 1 mg/mL的WC、PEWC、PEAWC、WCP、PEWCP、PEAWCP样品酶解液，0.4 mL 50 mmol/L邻苯三酚，混匀，反应3 min后，立即加入100 μL 3%抗坏血酸终止反应，迅速取1 mL至试管中，加4 mL蒸馏水混匀，以蒸馏水调零，于波长325 nm处测定吸光度A1；用0.4 mL蒸馏水代替邻苯三酚，测定吸光度值A2；用1 mL蒸馏水代替样品酶解液，测得吸光度值A0。O2-·清除率计算公式如下：

（3）DPPH自由基清除能力的测定[22]

分别取2 mL 1 mg/mL的WC、PEWC、PEAWC、WCP、PEWCP、PEAWCP样品酶解液于18支10mL试管中，分别加入2 mL 0.1 mmol/L的DPPH，混匀，室温暗处放置30 min，以无水乙醇调零，于波长517nm处测定吸光度值A1；用2 mL无水乙醇代替DPPH，测定吸光度值A2；用2 mL无水乙醇代替样品酶解液，测定吸光度值A0。DPPH·清除率计算公式如下：

（4）总还原力的测定[16]

分别取2 mL 1 mg/mL的WC、PEWC、PEAWC、WCP、PEWCP、PEAWCP样品酶解液于18支10 mL试管，分别加入2 mL 0.2 mol/L磷酸盐缓冲液（pH 6.6），混匀，2 mL 1%铁氰化钾，混匀，50℃水浴保温20 min，迅速冷却至室温，向混合物中加入2mL10%三氯乙酸终止反应，3 000 r/min离心10 min。取上清液2 mL，加2 mL蒸馏水及0.4 mL 0.1%三氯化铁溶液，混匀，室温放置10 min，以蒸馏水调零，于波长700 nm处测定吸光度值A，其吸光度值越大，表明还原能力越强。

2 结果与分析

2.1 核桃饼粕中蛋白含量

核桃饼粕及经不同方式处理的核桃饼粕各样品中蛋白质含量检测结果见表2。由表2可知，各核桃饼粕原料的蛋白质含量从大到小分别为PEWC＞PEAWC＞WC，PEWCP＞PEAWCP＞WCP，结果表明，石油醚脱脂处理后的核桃饼粕及核桃饼粕分离蛋白的蛋白质含量均大于其余两种处理方式。这可能是由于未脱脂的核桃饼粕及核桃饼粕分离蛋白中含有较多油脂，经过石油醚及丙酮二次脱脂后破坏了部分蛋白质，故蛋白质含量降低。

表2 各核桃饼粕原料的蛋白质含量Table 2 Protein contents of the different walnut cake raw materials

2.2 酶解产物体外抗氧化活性的测定

2.2.1 酶解产物的羟基自由基（OH·）清除率

图1WC、PEWC、PEAWC、WCP、PEWCP、PEAWCP的酶解产物对OH·的清除能力Fig.1 Scavenging activity of enzymolysis products of WC,PEWC, PEAWC,WCP,PEWCP,and PEAWCP on OH·

由图1可知，碱性蛋白酶酶解时，对OH·清除能力从强到弱分别为PEWC＞WC＞PEAWC，PEWCP＞PEAWCP＞WCP，PEWC和PEWCP酶解液对OH·清除作用较强，PEWC和PEWCP对OH·清除率分别为18.74%、18.09%，直接进行酶解的样品与经过碱溶酸沉提取蛋白再酶解的样品对OH·的清除作用差异不显著；胃蛋白酶酶解样品时，对OH·清除能力从强到弱分别为PEWC＞WC＞PEAWC，WCP＞PEWCP＞PEAWCP，经过碱溶酸沉提取蛋白再酶解的样品对OH·的清除作用明显强于直接进行酶解的样品；胰蛋白酶酶解样品时，对OH·的清除能力从强到弱分别为PEAWC＞PEWC＞WC，PEWCP＞PEAWCP＞WCP，其中PEWCP对OH·清除率最高，达21.44%，且经过碱溶酸沉提取蛋白再酶解的样品对OH·的清除作用明显强于直接进行酶解的样品。

碱性蛋白酶酶解物OH·清除率高的主要原因是碱性蛋白酶酶解蛋白可产生大量的疏水性氨基酸，疏水性氨基酸易于与自由基结合从而产生良好的OH·清除能力[14，23]，胰蛋白酶酶解物的OH·清除率高的主要原因是胰蛋白酶酶解蛋白可产生大量的精氨酸、赖氨酸等碱性氨基酸的肽键[15]，此外，胰蛋白酶分解核桃蛋白的速率高于胃蛋白酶，使胰蛋白酶能快速水解已溶于水的蛋白，加快酶与自由基的结合从而产生良好的OH·清除能力[24]。

直接酶解的WC、PEWC、PEAWC酶解液中，碱性蛋白酶水解PEWC的OH·清除率最高，达18.74%；经碱溶酸沉提取蛋白再酶解的WCP、PEWCP、PEAWCP酶解液中，胰蛋白酶水解PEWCP的OH·清除率最高，达21.44%。PEWC经碱性蛋白酶、胃蛋白酶酶解后对OH·的清除作用强于WC和PEAWC，PEWCP经碱性蛋白酶、胰蛋白酶酶解后对OH·的清除作用强于WCP和PEAWCP，其原因可能是WC、WCP未经石油醚脱脂，其中含有较多的脂肪和碳水化合物等杂质，对蛋白酶解反应影响，使OH·的清除率降低，PEAWC、PEAWCP由于先后使用石油醚和丙酮脱脂，两者均为有机溶剂，丙酮二次脱脂可能造成部分核桃饼粕蛋白变性和破坏，导致OH·的清除率降低[25]。

从清除OH·角度出发，碱性蛋白酶酶解PEWC和胰蛋白酶酶解PEWCP的清除作用较强。

2.2.2 酶解产物的超氧阴离子自由基（O2-·）清除率

图2WC、PEWC、PEAWC、WCP、PEWCP、PEAWCP的酶解产物对O2-·的清除能力Fig.2 Scavenging activity of enzymolysis products of WC,PEWC, PEAWC,WCP,PEWCP,and PEAWCP on O2-·

由图2可知，碱性蛋白酶、胃蛋白酶和胰蛋白酶酶解WC、PEWC、PEAWC、WCP、PEWCP、PEAWCP得到的酶解液对O2-·的清除作用均呈现相似的规律，其清除O2-·的能力从强到弱分别为PEWC＞WC＞PEAWC，PEWCP＞WCP＞PEAWCP，经石油醚脱脂处理的核桃饼粕及核桃饼粕分离蛋白的酶解液对O2-·清除作用均分别强于其他两种处理。

直接酶解的WC、PEWC、PEAWC酶解液中，碱性蛋白酶水解PEWC的O2-·清除率最高，达28.44%；经碱溶酸沉提取蛋白再酶解的WCP、PEWCP、PEAWCP酶解液中，胃蛋白酶水解PEWCP的O2-·清除率最高，达30.23%，其次是碱性蛋白酶水解PEWCP，达29.65%。碱性蛋白酶酶解PEWC和胃蛋白酶酶解PEWCP有良好的OH·清除作用。

经碱溶酸沉提取蛋白再酶解的胃蛋白酶酶解液和胰蛋白酶酶解液对O2-·的清除作用显著强于直接进行酶解的样品，其原因可能是核桃饼粕经过碱溶酸沉提取蛋白后杂质减少，利于酶解反应，从而增强对O2-·的清除作用[26]。

从清除O2-·角度出发，碱性蛋白酶酶解PEWC和胃蛋白酶酶解PEWCP的清除作用较强。

2.2.3 酶解产物的DPPH·清除率

由图3可知，经石油醚脱脂再酶解对DPPH·清除率较高，但经石油醚和丙酮二种溶剂脱脂再酶解对DPPH·清除率最低，其原因可能是PEAWC、PEAWCP由于先后使用石油醚和丙酮脱脂，造成部分蛋白质的变性或破坏，导致酶解液对DPPH·的清除率降低[25]。经碱溶酸沉提取蛋白再用胃蛋白酶和胰蛋白酶酶解WCP、PEWCP、PEAWCP的DPPH·清除率均大于直接酶解的WC、PEWC、PEAWC样品，其原因可能是核桃饼粕经过碱溶酸沉提取蛋白后杂质减少，利于酶解反应、利于抑制反应体系中产物的生成，从而增强对DPPH·的清除作用。

图3WC、PEWC、PEAWC、WCP、PEWCP、PEAWCP的酶解物对DPPH·的清除能力Fig.3 Scavenging activity of enzymolysis products of WC,PEWC,PEAWC,WCP,PEWCP,and PEAWCP on DPPH·

直接酶解的WC、PEWC、PEAWC酶解液中，碱性蛋白酶水解PEWC的DPPH·清除率达79.96%，显著高于其他处理样品；经碱溶酸沉提取蛋白再酶解的WCP、PEWCP、PEAWCP酶解液中，胰蛋白酶酶解液对DPPH·的清除率均大于碱性蛋白酶酶解液和胃蛋白酶酶解液，其中胰蛋白酶水解PEWCP的DPPH·清除率达80.22%，显著高于其他处理样品。

从清除DPPH·角度出发，碱性蛋白酶酶解PEWC和胰蛋白酶酶解PEWCP的清除作用较强。

2.2.4 酶解产物总还原力的的测定

图4WC、PEWC、PEAWC、WCP、PEWCP、PEAWCP酶解物的总还原力Fig.4 Total reducing power of enzymolysis products of WC,PEWC, PEAWC,WCP,PEWCP,and PEAWCP

由图4可知，碱性蛋白酶、胰蛋白酶酶解WC、PEWC、PEAWC、WCP、PEWCP、PEAWCP的总还原力显著高于胃蛋白酶酶解的对应样品，当直接酶解WC、PEWC、PEAWC时，胰蛋白酶水解PEWC的还原力最大，吸光度值为0.710；经碱溶酸沉提取蛋白再酶解WCP、PEWCP、PEAWCP时，碱性蛋白酶水解PEWCP的总还原力最大，吸光度值为0.762。与胃蛋白酶酶解液相比，碱性蛋白酶和胰蛋白酶酶解液含有更多的抗氧化剂，给出电子的能力较强。

采用碱性蛋白酶酶解时，总还原力从强到弱分别为WC＞PEAWC＞PEWC，PEWCP＞WCP＞PEAWCP；采用胃蛋白酶酶时，总还原力从强到弱分别为PEAWC＞WC＞PEWC，PEWCP＞WCP＞PEAWCP，胰蛋白酶酶解液的总还原能力相差不大。

从还原能力的角度出发，胰蛋白酶酶解PEWC和碱性蛋白酶酶解PEWCP还原能力较强。

3 结论

碱性蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶直接酶解WC、PEWC、PEAWC的酶解液中，碱性蛋白酶酶解PEWC的OH·、O2-·和DPPH·清除率最高，分别为18.74%、28.44%和79.96%；胰蛋白酶酶解PEWC的总还原力最大；经碱溶酸沉提取蛋白再酶解的WCP、PEWCP、PEAWCP酶解液，胰蛋白酶酶解PEWCP的OH·清除率和DPPH·清除率最高，分别为21.44%和80.22%，胃蛋白酶酶解PEWCP的O2-·清除率最高，达30.23%，碱性蛋白酶酶解PEWCP的总还原力最大。

石油醚脱脂为核桃饼粕原料最佳的处理方式。经碱溶酸沉先提取核桃饼粕中的蛋白质，获得核桃饼粕分离蛋白后，酶解液的抗氧化活性略高于直接酶解核桃饼粕的酶解液，但考虑原料处理成本，可选择用石油醚脱出核桃饼粕的油脂后直接酶解，且碱性蛋白酶酶解液的抗氧化活性高。鉴于核桃饼粕蛋白消化酶解产物具有较高的抗氧化活性，有望在与抗氧化相关的抗衰老和改善老年痴呆方面发挥重要作用。

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TS229

0254-5071（2017）05-0170-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.05.036

2016-12-29

云南省教育厅重大专项（ZD2014009）；2016云南省科技厅-云南中医学院联合专项（YN2016006）

罗燕（1992-），女，硕士研究生，研究方向为中药资源开发与利用。

*通讯作者：赵声兰（1962-），女，教授，硕士，研究方向为药食资源开发与利用。