介导细胞凋亡的caspase- 3在卵巢癌中的表达和放疗敏感性的关联性研究

张春年，王建中

(赣州市人民医院，江西 赣州 341400)

·论 著·

介导细胞凋亡的caspase- 3在卵巢癌中的表达和放疗敏感性的关联性研究

张春年，王建中

(赣州市人民医院，江西 赣州 341400)

目的:研究介导细胞凋亡的caspase- 3在卵巢癌中的表达和放疗敏感性的关系。方法：通过对临床不同时期卵巢组织样本的收集及凋亡相关因子mRNA和蛋白的检测，以及免疫组化法定位、定量caspase- 3在不同时期卵巢癌中的变化来研究不同时期卵巢癌细胞凋亡情况。通过射线照射细胞然后对细胞进行计数统计，以研究不同种类卵巢癌细胞的放射敏感性。结果：免疫组化、PCR、Western Blot结果显示，随着卵巢细胞的癌变，凋亡的存活基因bcl2被激活，凋亡致死基因bax被抑制，凋亡执行蛋白caspase- 3数量下降。同时射线照射和细胞统计结果显示，不同类型卵巢癌细胞对放射敏感性不同。结论：caspase- 3蛋白数量随着卵巢癌变而下降，而对于卵巢癌变细胞来说，caspase- 3蛋白含量越多，放射敏感性越强。

卵巢癌； 细胞凋亡； caspase- 3； 放射敏感性

卵巢恶性肿瘤是女性生殖器官最常见的肿瘤之一，仅次于宫颈癌和子宫体癌[1]，其死亡率排在妇科肿瘤首位，加之早期症状不典型，对妇女造成严重的危害[2]。卵巢癌以腺癌为主，包括三大类：一是浆液性腺癌，最常见的原发性卵巢恶性肿瘤，占所有卵巢恶性肿瘤的40%～60%;二是黏液性腺癌，发病率占恶性肿瘤的10%～20%；三是透明细胞癌，原发性卵巢恶性肿瘤中发生率约为6%。不同分类的卵巢癌放疗敏感性差别较大[3]，因此研究了解不同种类卵巢癌对放疗敏感性的差异尤为重要[4]。

细胞死亡的方式有凋亡和坏死两种[5]。凋亡是细胞编程性死亡，正常存在于细胞生长和衰老过程中，是平衡组织内细胞数量的重要机制[6]。恶性肿瘤细胞一旦形成，凋亡机制受到破坏，癌细胞无限增殖与转移到各个组织和器官，给人体带来毁灭性影响。放疗是治疗癌症的常用手段，是通过放射诱导癌细胞凋亡实现肿瘤细胞的清除和抑制肿瘤细胞增殖的，但是不同的癌变器官、不同组织类型对放射敏感性差异较大[7]。利用放疗治疗卵巢癌的同时，首先要了解不同类型卵巢癌对放疗的敏感性[8]。大量资料显示，在肿瘤细胞凋亡中casepase被激活[9]。caspase- 3作为caspase级联反应下游最关键的凋亡执行者，在肿瘤细胞治疗中发挥重要作用[10]。本研究主要探讨卵巢癌细胞中caspase- 3的表达情况与放射敏感性的关系。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

1.1.1 试剂 RNA抽提试剂Trizol和M- MLV反转录试剂盒购自Sigma公司；NC膜购自Millipore公司；配制蛋白染色液的丽春红、三氯乙酸和磺基水杨酸均购自Invitrogen公司；蛋白印迹化学发光试剂SuperSignal® West Pico Chemiluminescent Substrate购自Thermo Scientific公司；X- Omat光片购自Kodak公司。DMEM培养基购自Yazyme公司；胎牛血清(FBS, Fetal Bovine Serum)购自GIBCO公司；Trypin、青链霉素(penicillin- streptomycin)和L- Glutamine均购自Sigma公司；细胞培养皿、冻存管和离心管购自Corning公司。

1.1.2 仪器 微量移液器购自Eppendorf公司;高速离心机购自Beckman公司;PCR仪购自Bio- Rad;精密天平购自Mettler Toledo公司;荧光显微镜Olympus IX71购自日本Olympus公司;实时荧光定量PCR系统购自Applied Biosystems公司;4/-20 ℃冰箱购自海尔公司;垂直电泳槽、湿转转膜仪和配套电源均为国内公司产品，X光片洗片机购自Kodak公司；荧光显微镜为Olympus公司产品。

1.2 方法

1.2.1 样本收集 收集本院患者正常卵巢组织14例、卵巢癌前组织17例、卵巢癌变组织21例。每例均取两块组织，一块用甲醛固定，备于制作蜡块；另一块立即保存于-180 ℃的液氮中，备于提取mRNA和蛋白。

1.2.2 免疫组化法检测 脱蜡、水化组织切片，根据所应用的一抗的特殊要求对组织抗原进行修复。3%H2O2去离子水孵育10 min，以阻断内源性过氧化物酶。缓冲液PBS冲洗，2 min 3次。滴加一抗，37 ℃孵育2 h，PBS冲洗，2 min 3次。滴加试剂1，室温孵育20 min，PBS冲洗，2 min 3次。滴加试剂2，室温孵育25 min，PBS冲洗，2 min 3次。最后一步，应用DAB溶液显色。

1.2.3 细胞培养 3AO为人黏液性卵巢癌细胞系，skov3为人浆液性卵巢癌细胞系，ES- 2为人卵巢透明细胞癌细胞系，购自上海赛齐生物工程有限公司。使用含10%胎牛血清的DMEM培养液静置培养于保持37 ℃、含5%CO2的细胞培养箱，DMEM完全培养液中含有100 U·ml-1的青霉素及100 μg·ml-1的链霉素。

1.2.4 Trizol一步法提取mRNA 先取50～100 mg卵巢组织加入1 ml Trizol液，研磨成液体后室温放置5 min，再以每1 ml Trizol液加入0.2 ml氯仿，注意要盖紧离心管，用手剧烈摇荡离心管15 s。等到分层后取最上层水相转移至新的离心管，然后按每1 ml Trizol液加0.5 ml异丙醇，再室温放置10 min，然后离心机中12 000 g离心10 min。丢弃上清液，按每1 ml Trizol液加入1 ml 75%乙醇，振荡混匀，样品4 ℃下7 500 g离心5 min。再次弃去上清液，真空干燥5～10 min。最后计算浓度与纯度，用75%乙醇溶解mRNA，置于-80 ℃ 冰箱中保存备用，行RT- PCR检测。

1.2.5 免疫印迹法检测 用RIPA裂解细胞后进行蛋白浓度测定，再用6 XLoading制样，高温蛋白变性。用10%的SDS- PAGE胶上样电泳,80 V恒压先跑30 min左右，待蛋白进入分离胶后改120 V恒压再跑直至得到想要的蛋白条带。电泳结束后进行湿转，以300 mA恒流将蛋白电转到NC膜上，用含5%脱脂奶粉的TBST溶液封闭NC膜2 h。封闭结束后加入配制在含5%BSA的TBST中的一抗，4 ℃过夜。第2天在含5%脱脂奶粉的TBST的二抗(1∶2 000～1∶3 000)中孵育，室温结合3h，再用TBST洗膜3次。加入显色底物反应3min，用保鲜膜包好压片，曝光显影，可以根据结果调整曝光时间。

1.3 统计学处理

定量数据都以均数±标准差表示，使用GraphpadPrism4.0软件进行One-wayAnouva统计分析，当P<0.05时认为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 检测不同时期卵巢组织中凋亡相关因子mRNA表达情况

凋亡是放疗调节细胞的主要机制，所以我们首先检测不同时期卵巢组织中凋亡的情况。细胞凋亡发生的原因和途径是复杂多样的，许多基因参与细胞凋亡的基因调控，包括致死基因和存活基因。bcl- 2家族成员在细胞凋亡的基因调控过程中起着至关重要的作用[9]，是一类抗细胞凋亡基因，代表基因是bcl- 2基因[11]；另一类是促细胞凋亡基因，代表基因是bax基因[12]，他们通过激活一系列下游基因发挥调节凋亡作用[13]。caspase- 3是caspase级联反应下游最关键的凋亡执行者，它的表达情况也非常重要。因此，我们主要检测了bcl- 2[9]、bax、caspase- 3三者不同时期卵巢组织中mRNA表达情况。结果发现，随着卵巢组织癌变致死基因bax的mRNA表达量显著下调，同时存活基因bcl- 2的mRNA表达量显著上调，caspase- 3的mRNA表达情况与bax相同，显著下调，说明凋亡通路被抑制(图1)。

*P<0.05;**P<0.01

图1 不同时期卵巢组织中凋亡相关因子mRNA表达情况

Fig 1 Expression of apoptosis related factor mRNA in ovarian tissues at different stages

2.2 检测不同时期卵巢组织中凋亡相关因子蛋白的表达情况

为了验证以上结果，我们检测了bcl2、bax、caspase- 3三者不同时期卵巢组织中蛋白表达情况。结果发现，卵巢组织癌变致死基因bax的蛋白表达量显著下调，同时存活基因bcl2的蛋白表达显著上调，caspase- 3的蛋白表达情况与bax相同，显著下调，证明卵巢癌中凋亡通路确实被抑制，癌细胞进入无限增殖状态(图2)。

2.3 用免疫组化方法定量不同时期卵巢组织中caspase- 3表达

将正常卵巢组织、卵巢癌前组织、卵巢癌变组织甲醛固定，制作成蜡块，用于免疫组化检测。在正常卵巢组织中caspase- 3表达量高，主要分布在细胞核周围，卵巢组织排列和细胞的形态相对整齐(图3A)。在卵巢癌变前组织中，caspase- 3表达量明显下降，且卵巢组织多空泡化，结构不完整(图3B)。在卵巢癌变组织中caspase- 3几乎不表达，且卵巢组织结构被破坏，细胞结构被破坏，全部为细胞核(图3C)。统计不同时期卵巢癌病理中caspase- 3阳性率，正常卵巢组织caspase- 3表达阳性率高，卵巢癌前组织、卵巢癌变组织病例caspase- 3表达阳性率低(表1)。

图2 不同时期卵巢组织中凋亡相关因子蛋白的表达情况

Fig 2 Expression of apoptosis related factors in ovarian tissues at different stages

A.正常卵巢组织；B.卵巢癌变前组织；C.卵巢癌变组织

A.Normal ovarian tissue; B.Ovarian precancerous tissue; C.Ovarian cancer tissue

图3 caspase- 3在卵巢组织中的表达

Fig 3 Expression of caspase- 3 in ovarian tissue

表1 caspase- 3在不同期卵巢组织中表达结果

Tab 1 Statistical results of caspase- 3 expression in different stages of ovarian tissue

时 期ncaspase⁃3表达量/例-+阳性率/%正常卵巢组织1411392．8卵巢癌变前组织1714321．4卵巢癌变组织2117423．5

2.4 不同类型卵巢癌细胞中caspase- 3表达情况

人黏液性卵巢癌细胞3AO中caspase- 3蛋白表达量最高，人卵巢透明细胞癌细胞skov3中caspase- 3蛋白表达量最低，人卵巢透明细胞癌细胞ES- 2中的表达量居中(图4)。

图4 不同类型卵巢细胞中凋亡相关因子蛋白的表达情况

Fig 4 Expression of apoptosis related factors in different types of ovarian cells

2.5 不同类型卵巢癌细胞对放疗的敏感性

用6Galxy照射细胞12、24 h后检测细胞的数量，结果发现24 h后人黏液性卵巢癌细胞3AO 数量下降最显著(图5)。

*P<0.05;**P<0.01

图5 6Galxy照射细胞12、24 h后不同类型卵巢细胞数量

Fig 5 Different types of ovarian cell number after 6Galxy irradiated cells 12，24 h

2.6 卵巢癌细胞过表达caspase- 3对放射敏感性的影响

caspase- 3过表达后bcl2蛋白量减少,bax蛋白量增加，说明凋亡被再次激活(图6)。检测人黏液性卵巢癌细胞3AO照射6Galxy 12、24 h后细胞的数量，结果发现caspase- 3过表达后凋亡通路加强，癌细胞对放射线敏感性变强(图7)。

图6 人黏液性卵巢癌细胞3AO过表达caspase- 3后凋亡因子变化

Fig 6 Changes of apoptosis factor after caspase- 3 overexpression of 3AO in human mucinous ovarian cancer cells

3 讨 论

在2015年,估计有21 290例卵巢癌发生在美国，大多数卵巢癌女性发现时已为晚期[14]。只有45.6%的女性在与卵巢癌的斗争中能存活疾下来,预计2015年，就有14 180人死于卵巢癌[15]。美国黑人女性因不容易诊断卵巢相关疾病而最后大多死于卵巢癌,因此美国黑人女性的生存时间比白人女性短，即使发病阶段和时期相同。大多数卵巢癌被认为是散发病例,他们发生在没有明显的卵巢癌家族史的妇女,没有找一个能增强卵巢癌易感性的遗传突变基因[4]。因此，关于卵巢癌的研究与治疗一直比较局限，能在原有治疗上增强和完善治疗效果尤为重要。

*P<0.05

图7 人黏液性卵巢癌细胞3AO过表达caspase- 3后对放射的敏感性

Fig 7 The radiation sensitivity of human mucinous ovarian cancer cell line 3AO after caspase- 3 overexpression

放疗是比较传统的治疗卵巢疾病的方法，但是因为不同的卵巢癌变类型对放疗的敏感性不同，因此作者主要研究不同类型卵巢癌对放疗敏感性的问题。结果发现，黏液性卵巢癌比浆液性卵巢癌细胞和卵巢透明细胞癌对放射敏感性要强，并且放射敏感性与凋亡执行蛋白caspase- 3的含量相关[16]。

细胞凋亡的调节是非常复杂的,参与的分子非常多,还有很多需要我们进一步的探索[17]。caspase- 3一直被认为是介导细胞凋亡的关键性蛋白酶，也存在一些研究证明caspase- 3能调节细胞内信号转导[9]。caspase- 3蛋白是普遍存在的,随着从癌前病变发展至癌caspase- 3蛋白表达量基本呈递减趋势[18]。近期，研究表明caspase- 3不但可以直接诱导肿瘤细胞的凋亡,而且可以提高肿瘤细胞的放射敏感性，但其早期诊断和治疗仍处于摸索阶段。建立快速、灵敏、准确预测癌细胞辐射敏感性的方法,实现肿瘤放射治疗的个体化,使用不同生物标志单独或联合进行研究,为今后人类治愈卵巢癌提供了基础。虽然结果与临床应用还有一定距离,但随着对卵巢癌发生机制认识的不断深入,放疗前后联合检测凋亡相关蛋白在患者癌组织的表达水平和癌细胞凋亡水平的变化[19- 21],筛选判断肿瘤细胞放疗敏感性的指标,最终可使生物标志用于临床辐射敏感性的预测,针对不同的患者采取个体化的放射治疗模式(包括放疗的剂量、分割方案的制定、放射增敏药物的应用等),从而提高卵巢癌放疗的治愈率。casepase- 3含量多，凋亡通路更能响应放疗，这对临床放射治疗不同类型的卵巢癌细胞具有指导意义。

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(本文编辑：周兰波)

The correlation between caspase- 3 mediated apoptosis and radiation sensitivity in ovarian cancer

ZHANG Chun- nian,WANG Jian- zhong

(GanzhouPeople’sHospital,Ganzhou341400,China)

Objective: To study the caspase- 3 mediated apoptosis in ovarian cancer, and the relationship between the caspase- 3 expression and radiation sensitivity. Methods: Through the clinical ovarian tissue samples collected at different periods and apoptosis related gene mRNA and protein detection, and immunohistochemical legal, quantitative caspase- 3 protein changes in ovarian cancer in different periods, the apoptosis in ovarian cancer in different periods was studied. By rays irradiation, and then the number of cells was counted, in order to study different types of ovarian cancer cells radiation sensitivity. Results: Immunohistochemistry, PCR, Western Blot, results with ovarian cells canceration showed that survival bcl- 2 genes of apoptosis was activated, lethal gene bax of apoptosis was inhibited, the apoptosis protein caspase- 3 declined. At the same time, rays irradiation and statistical results showed that the different types of ovarian cancer cells to radiation sensitivity were different. Conclusion: Caspase- 3 protein quantitied with ovarian canceration is declining, but for ovarian cancer cells, the more caspase- 3 protein is, the stronger radiation sensitivity is.

ovarian cancer; apoptosis; caspase 3; radiation sensitivity

2016- 09- 27

2016- 12- 17

江西省自然科学基金资助项目(2010JX02228)

张春年(1978-)，女，江西南康人，主治医师，医学硕士。E- mail:hex518000@126.com

张春年,王建中.介导细胞凋亡的caspase- 3在卵巢癌中的表达和放疗敏感性的关联性研究[J].东南大学学报:医学版,2017,36(2):176- 181.

R737.31

A

1671- 6264(2017)02- 0176- 06

10.3969/j.issn.1671- 6264.2017.02.009