FOXE1基因单核苷酸多态性与甲状腺乳头状癌临床易感的相关性研究

梁 羽，谢建平，温琥玲，杨耀午，曹龄之，仇文杰(.四川省医学科学院·四川省人民医院超声科，四川 成都 6007；.川北医学院附属医院核医学科，四川 南充 63700)

FOXE1基因单核苷酸多态性与甲状腺乳头状癌临床易感的相关性研究

梁 羽1，谢建平2，温琥玲2，杨耀午2，曹龄之2，仇文杰2
(1.四川省医学科学院·四川省人民医院超声科，四川 成都 610072；2.川北医学院附属医院核医学科，四川 南充 63700)

目的 探讨四川南充地区汉族人群中FOXE1基因单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms，SNP)与甲状腺乳头癌(papillary thyroid carcinoma，PTC)临床易感的关系。方法 选取150例PTC患者与180例汉族正常人群。以FOXE1基因 rs535522715、rs111482243、rs965513、rs1867277、rs1867278、rs531484350、rs549601899位点作为遗传标记，用基因测序法检测FOXE1基因单核苷酸多态性。结果 FOXE1基因rs535522715、rs111482243、rs531484350、rs549601899在甲状腺乳头状癌组及正常人群组均未检测出突变。与正常人群组的比较，甲状腺乳头状癌组rs1867278等位基因及基因型频率组间分布差异有统计学意义(P< 0.05)，rs965513、rs1867277等位基因及基因分型频率组间分布差异无统计学意义(P> 0.05)，且rs1867278在甲状腺乳头状癌组携带C等位基因风险是正常人群组的1.92倍(OR=1.92，95%CI=1.244～2.969，P= 0.003)。结论 FOXE1基因rs1867278与甲状腺乳头状癌的临床易感性具有相关性，rs1867278位点C等位基因是甲状腺乳头状癌的风险等位基因。

甲状腺乳头状癌；FOXE1基因；单核苷酸多态性；相关性

甲状腺癌(thyroid carcinoma，TC)是内分泌系统常见恶性肿瘤之一。目前，全世界TC发病率处于逐步上升趋势，女性发病率高于男性，城市发病率高于农村，沿海地区高于内陆地区，而且趋向年轻化发展[1]；不同地域、不同种族发病病理类型及发病年龄存有差异[2]；但是TC的死亡率很低，最近几年未见明显波动[3]。研究表明TC发生为多基因、多因素共同作用，但具体确切病因未明。近年来国外文献报道，由FOXE1基因编码甲状腺转录因子2与甲状腺乳头状癌(PTC)临床易感具有相关性[4]，但单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms，SNP)易受人种、地域、饮食文化等多方面差异影响，在四川南充地区的汉族人种中是否具有类似效应，将是本研究探讨的内容，为进一步深入研究、治疗、预防TC提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 一般资料 收集2013年11月至2015年3月川北医学院附属医院核医学科经病理诊断明确且首次131I清除甲状腺残留组织前的PTC患者的血液样本为甲状腺乳头状癌组(PTC组)共150例，其中女117例，男33例。收集我院体检中心体检健康者血液样本185例为正常人群组(NC组)，其中女145例，男40例。由于用两种不同引物扩增出两条不同的基因片段，rs535522715、rs111482243、rs965513三个SNP位点与rs1867277、rs1867278、rs531484350、rs549601899四个SNP位点分别属于FOXE1基因的两条基因片段上，各基因片段扩增成功率有所不同，因此分为两大类数据。见表1。

表1 不同SNP位点两组一般资料比较 (n)

1.2 方法

1.2.1 血液全基因组DNA提取 血液基因组DNA提取试剂盒(DP319)购自天根生化科技(北京)有限公司。所提取的DNA经凝胶电泳检测合格后，置-20 ℃冰箱冻存备用。

1.2.2 引物设计 由Primer 5.0引物设计软件设计，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，详见表2、表3。

表2 不同SNP 位点的引物DNA序列、退火温度、扩增长度

表3 SNP 位点的引物DNA序列、退火温度、扩增长度

1.2.3 PCR 扩增 25.0 μl反应体系包括DNA模板2.0 μl，上下游引物各1.0 μl，2 ×Master Mix (含染料)11.0 μl，灭菌水10.0 μL。PCR扩增反应采用型号C1000TMThermal cycler(美国Bio-Rad公司)扩增仪。反应流程：95°预变性，4 min；进入循环：变性94°，50 s；退火温度，35 s；延伸72 ℃，35 s；共35个循环。终末延伸72 ℃，5 min。取PCR产物6 μL在含G0LDVIEW染色液的1.0%琼脂糖凝胶电泳，以90 V电压电泳25 min后，将凝胶置于凝胶成像系统(美国Bio-Rad公司)中观察结果，观察扩增是否成功。

1.3 PCR扩增产物基因测序 将合格的PCR扩增产物寄至上海生工生物工程股份有限公司进行双向引物测序，测序结果由专用Chromas看图软件分析，并通过BLAST 基因服务站进行同源性对比分析，判断突变结果。

1.4 统计学方法 使用SPSS 13.0进行统计分析。用拟合优度卡方检验验证SNP的基因型分布频率是否符合哈迪-温伯格(Hardy-Weinberg Law)遗传定律；计数资料组间比较采用卡方检验。P< 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PCR产物扩增电泳结果rs535522715、rs111482243、rs965513扩增目的片段420 bp；rs1867277、rs1867278、rs531484350、rs549601899扩增目的片段465 bp。扩增成功基因条带见图1、图2。

图1 rs535522715、rs111482243、rs965513扩增目的片段

图2 rs1867277、rs1867278、rs531484350、rs549601899扩增目的片段

2.2 FOXE1基因型分析①FOXE1基因rs535522715g/G、rs1114822 43T/T、rs531484350A/A、rs549601899g/G在甲状腺乳头状癌组及正常人群组均未检测出突变。②FOXE1基因rs965513A/G位点突变模式是G→A，测序图见图3。③FOXE1基因rs1867277 A/G位点突变模式是G→A，测序图见图4。④FOXE1基因rs1867278 A/C位点突变模式是C→A，测序图见图5。

2.3 FOXE1基因与甲状腺乳头状癌的临床易感相关性分析 与正常人群组的比较，rs1867278等位基因及基因型频率在组间分布差异有统计学意义(P< 0.05)，rs965513、rs1867277等位基因及基因分型频率在组间分布差异无统计学意义(P> 0.05)，且rs1867278在甲状腺乳头状癌组携带C等位基因风险是正常人群组的1.92倍(OR=1.92，95%CI=1.244～2.969，P= 0.003)，见表4与表5。

图3 rs965513测序图 a：未突变(G/G)，黑色单峰(黑色箭头)； b：突变(A/G)，绿色与黑色杂峰(红色箭头)

图4 rs1867277测序图 a：未突变(G/G)，黑色单峰(黑色箭头)； b：突变(A/G)，绿色与黑色杂峰(红色箭头)

图5 rs1867278测序图 a：未突变(C/C)，蓝色单峰(黑色箭头)； b：突变(A/A)，绿色单峰(红色箭头)

组别rs965513AAAGGGrs1867277AAAGGGrs1867278AAACCCPTC组3241236693669366NC组4301466664896213χ20 0491 4329 029P0 9760 4890 011

表5 三个SNP位点的等位基因比较

3 讨论

FOXE1基因位于染色体9q22，大小约3461 bp，只有一个外显子，其编码蛋白FOXE1转录因子属于Fox转录因子家族之一，广泛存在于生物界，在人体中主要表达于甲状腺组织与睾丸组织。FOXEl转录因子参与DNA依赖转录调控、RNA聚合酶II启动子转录和RNA聚合酶II启动子转录负调控等一系列生物过程[5]，对维持FOXE1基因的转录、翻译均有重要调节作用。而FOXE1基因主要通过基因突变、异常甲基化及基因多态性等三种方式改变导致FOXE1转录因子改变，从而影响人类的胚胎发育、细胞的生长分化及肿瘤发生。

目前，SNP作为第三代遗传标志，人体许多表型差异、对药物敏感差异、疾病的易感性等都可能与之相关。而在TC众多危险因素中，FOXE1基因的SNP已经很明确在TC致病过程中发挥重要作用[6]。国外在冰岛最先发现FOXE1 基因rs965513与欧洲人患TC的风险高度相关，此位点突变者约比非突变者高出约5.7倍TC患病风险[7]。随后，国外又发现FOXE1基因rs1867277位点同样是甲状腺癌致病位点，然而基因单核苷酸多态性与辐射剂量似乎作为独立的风险因素增加TC的易感[8]。然而，FOXE1基因片段上SNP位点还有许多，SNP位点受到地域、种族、气候、电离辐射、病毒、饮食文化、个人生活习惯等差异因素影响，在我国这种差异因素对甲状腺癌易感风险的影响程度同样存有差异，这就造成了本次研究的甲状腺癌中最常见的甲状腺乳头状癌的结果略和国际研究结果产生偏差。

本研究初步探索了四川南充地区汉族人种中FOXE1基因各SNP位点等位基因及基因分型的分布频率。如FOXE1 基因rs1867278基因分型频率为A/A(71.4%)、A/C(24.7%)、C/C(3.9%)，等位基因频率为A(83.8%)、C(16.2%)，这与北方吉林地区李鸿博[9]检测的FOXE1 rs1867278基因分型频率为A/A(74.5%)、A/C(23.8%)、C/C(1.7%)，等位基因频率为A(86.4%)、C(13.6%)略产生了差异。但这也对FOXE1基因 rs1867278在我国的基因分型频率有了大致了解，为评估PTC的患病风险提供了有效数据。本研究检测到FOXE1基因rs1867278与PTC临床易感存在显著的相关性(P< 0.05)，而rs965513、rs1867277两TC风险位点与PTC未检测到相关性(P> 0.05)。鉴于本次研究样本量所限，在四川南充汉族人种中，rs1867278位点是否可用来评估PTC易感风险，还需继续探索，同样对于rs965513、rs1867277两位点也不能完全排除其对PTC易感风险的影响。

国外研究认为FOXE1基因rs965513、rs1867277与PTC有相关性，而此次研究未体现其相关性。其原因可能是：①SNP受地域、种族、生活环境等差异因素影响。如在欧洲葡萄牙，Tomaz等[10]研究认为rs965513、rs1867277变异位点在增加葡萄牙人家族性及散发性甲状腺非髓质癌易感性上有强烈的相关，FOXE1基因突变与PTC发病存在关联。而在日本，Matsuse等[11]认为rs965513明显增加日本人患PPTC的风险，FOXE1基因SNP与BRAF基因v600e状态没有明确关联，rs1867277并未与PTC发病相关。并且，个人所受辐射剂量的高低对NKX2-1基因rs944289位点易感PTC同样存有差异[12]，并未提到FOXE1基因的SNP与个人辐射剂量也对PTC发生产生联系。②PTC致病危险因素复杂多样，存在相互因素协同作用。如我国朱晓娥等[13]研究认为在放射性环境下，rs965513与中国人PTC发病有关，rs1867277是甲状腺癌形成的易感因素之一。而英国Jones等[14]研究认为rs965513、rs1867277、rs944289、rs6983267 协同作用与PTC易感有重大关联，rs965513在PTC形成过程中起主导作用。我国蒋永新等[15]则发现FOXE1基因另一个SNP位点rs944289多态性中的T等位基因可能是PTC易感且转移的危险因素。然在动物实验[16]表明：适量FOXE1因子是维持甲状腺正常结构和功能的关键因素，FOXE1因子不直接参与PTC致癌过程，但过度表达会引起小鼠患结节性甲状腺肿。③研究样本量局限。SNP在大样本量的随机对照试验上的结果才准确可靠[17]，需随机扩大样本量范围才能最真实反映四川南充地区FOXE1基因SNP分布特征。

此外，FOXE1基因在PTC致病过程中的作用机制，多数研究[18，19]认为对PTC的侵袭转移肯定起一定作用，更多是与PAX-8、NKX2等基因协同作用，FOXE1基因并不是主要致癌基因。若单一特异性沉默FOXE1基因，则可能通过PTC细胞株TPC-1细胞上皮间质转化增强PTC细胞的侵袭潜能[20]。同时，FOXE1基因异常甲基化是另一致癌原因，在PTC中是低甲基化、高表达的异常表达模式，FOXE1启动子区域高甲基化则是PTC的一个保护因素[21]。FOXE1基因rs965513位点突变是由远范围内的至少3种增强子元件调控失调引起[22]；这3种增强元件至少包含rs7864322、rs12352658、rs7847449、rs10759944这四个位点。因此，FOXE1基因对PTC致病机制应该是多SNP位点联合作用，同样需要联合其它相关基因做全基因组关联研究才能获得PTC确切的分子生物学致病机制。

综上所述，FOXE1基因rs1867278与PTC的临床易感性具有相关性，rs1867278位点C等位基因是PTC的风险等位基因。FOXE1基因 rs535522715、rs111482243、rs965513、rs1867277、rs531484350、rs549601899位点单核苷酸多态性在本研究中与PTC临床易感可能不存在明显的相关性。但FOXE1基因rs965513、rs1867277两位点在PTC的患病风险评估、致癌机制、病理特征等方面的作用需要进一步探索印证。

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Association of single nucleotide polymorphism of FOXE1 gene with clinical susceptibility of papillary thyroid carcinoma

LIANGYu1，XIEJian-ping2，WENHu-ling2，YANGYao-wu2，CAOLing-zhi2，QIUWen-jie2
(1.DepartmentofUltrasound，SichuanProvincialPeople’sHospital，Chengdu610072，China； 2.DepartmentofNuclearMedicine，TheAffiliatedHospitalofNorthSichuanMedicalCollege，Nanchong637000，China)

Objective To investigate the correlation between FOXE1 single nucleotide polymorphisms (SNP) and papillary thyroid carcinoma (PTC) in a Han population of Sichuan Nanchong area.Methods A case control study was used to select 150 cases of papillary thyroid carcinoma and 180 cases of normal subjects of Han nationality.The rs535522715，rs111482243，rs965513，rs1867277，rs1867278，rs531484350 and rs549601899 loci of FOXE1 gene were used as genetic markers.The gene sequencing method was used to detect FOXE1 gene SNP.Results No mutation in FOXE1 gene at rs535522715，rs111482243，rs531484350 and rs549601899 loci was found in the carcinoma group or the normal group.Frequency distribution of rs1867278 allele in the carcinoma group was different from the control group (P< 0.05) while frequency distribution of rs965513 and rs1867277 alleles was not significant between the two groups (P> 0.05).Moreover，gene risk of rs1867278 in the carcinoma group carrying 'C' was 1.92 times as high as that of the normal group (OR=1.92，95%CI=1.244 ～ 2.969，P = 0.003).Conclusion FOXE1 gene rs1867278 is associated with the clinical susceptibility of papillary thyroid carcinoma，and the "C" allele of the rs1867278 locus is a risk allele for this type of carcinoma.

Papillary thyroid carcinoma； FOXE1 gene； Single nucleotide polymorphism； Correlation

R736.1；R394.3

A

1672-6170(2017)02-0029-05

2016-06-15；

2016-11-25)