BMP9通过ERK5信号通路调控根尖牙乳头干细胞成骨/成牙本质分化

孔令姣，王金华

（重庆医科大学附属口腔医院口腔疾病与生物医学重庆市重点实验室，重庆市高校市级口腔生物医学工程重点实验室，重庆401147）

BMP9通过ERK5信号通路调控根尖牙乳头干细胞成骨/成牙本质分化

孔令姣，王金华

（重庆医科大学附属口腔医院口腔疾病与生物医学重庆市重点实验室，重庆市高校市级口腔生物医学工程重点实验室，重庆401147）

目的研究骨形成蛋白9（BMP9）是否通过激活ERK5信号通路调控永生化根尖牙乳头干细胞（iSCAP）成骨/成牙本质向分化。方法首先使用ERK5抑制剂BIX02189作用于BMP9的腺病毒转染iSCAP，采用Western blotting检测ERK5蛋白的磷酸化水平变化；然后通过碱性磷酸酶（ALP）染色、RT-PCR及茜素红染色检测成骨/成牙本质相关基因Runx2、OCN、OPN和DMP1的表达，研究BMP9对iSCAP成骨/成牙本质分化的影响。结果BMP9可以上调ERK5磷酸化水平，BIX02189干预后ERK5磷酸化下降；ALP染色，RT-PCR检测表达及茜素红染色均发现BMP9可以促进Runx2、OCN、OPN、DMP1阳性表达，而BIX02189则抑制成骨/成牙本质分化。结论BMP9可以通过激活ERK5信号通路促进根尖牙乳头干细胞成骨/成牙本质分化。

永生化根尖牙乳头干细胞；骨形成蛋白9；ERK5；成骨/成牙本质分化

年轻恒牙常发生牙外伤或根尖周炎使牙根发育不足，而目前的治疗方案并不能解决牙根发育问题。所以通过组织再生工程促进骨重建和牙根再生是目前研究热点之一［1］。根尖牙乳头干细胞（stem cells from the apical papilla，SCAP）是由SONOYAMA［2］等从未发育完全的人牙根尖乳头中获得的，并发现它强大的自我更新、增殖和多向分化的能力。有学者［3］认为在牙髓坏死和根尖周炎症的病例中，SCAP是牙根再生最主要的成牙本质前体细胞。骨形成蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）在牙齿发生、形成、分化、基质分泌等过程中有着重要的作用［4］。本课题组前期已发现BMP9可以促进永生化根尖牙乳头干细胞（immortalized stem cells from the apical papilla，iSCAP）成骨/成牙本质分化，但具体机制尚不清楚。以往研究认为，BMP主要通过BMP-Smad信号通路发挥诱导细胞增殖和分化等生物学功能。但是有学者［5-6］认为，BMP也可通过丝裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinase，MAPK）等非经典途径进行信号转导。MAPK信号途径主要有p38、ERK1/2、JNK和ERK5 4种途径［7］，其中ERK5是最新发现的，其生物学作用也遵循三级激酶逐级放大模式［8］。但是ERK5信号通路在BMP9促进iSCAP成骨/成牙本质分化过程中的具体作用机制尚不清楚。

因此，本研究将利用ERK5抑制剂BIX02189作用于BMP9的腺病毒（adenovirus of bone morphogenetic protein 9，Ad-BMP9）转染的iSCAP，通过Western blotting，碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）染色，RT-PCR及茜素红染色检测其对iSCAP成骨/成牙本质分化的影响，初步探究ERK5信号通路在BMP9诱导iSCAP成骨/成牙本质分化过程中的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

小鼠iSCAP、HEK 293细胞、Ad-BMP9、对照腺病毒（adenovirus of green fluorescent protein，Ad-GFP）均由实验室保存。DMEM养基和胎牛血清（Gibco公司），BIX02189（Selleck公司）。ERK5一抗和磷酸化ERK5（P-ERK5）一抗（CST公司），ALP染色试剂盒（碧云天公司），RNA提取试剂盒、PCR反转录试剂盒、PCR荧光定量试剂盒（TaKaRa公司），茜素红S染色液（索莱宝公司）。

1.2 方法

1.2.1 实验分组：首先，培养目的细胞iSCAP并将其分为空白组，对照组（加入适量Ad-GFP），BMP9组（加入适量Ad-BMP9）和实验组（iSCAP感染Ad-BMP9后加入适量的ERK5抑制剂BIX02189）。

1.2.2 Western blotting检测：将iSCAP接种到10 cm培养皿中，36 h后提取目的蛋白，BCA法测蛋白浓度，按照Western blotting检测方法上样，转膜，封闭，孵育一抗、二抗，显影，保存图像。

图1 Western blotting检测各组P-ERK5蛋白的表达Fig.1 Western blotting analysis results of BMP9-induced phosphorylation of ERK5

1.2.3 ALP染色：将iSCAP接种到24孔板，于第5天染色。清洗固定，染色，清洗，扫描并用显微镜拍照。

1.2.4 RT-PCR：将iSCAP接种到6 cm培养皿中，于第7天提取目的细胞RNA，检测样本浓度和纯度。按照试剂盒说明书行RT-PCR，检测成骨/成牙本质相关基因Runx2、OPN、OCN、DMP1的mRNA的表达。所用引物序列见表1。

表1 PCR引物序列Tab.1 The sequence of primer for RT-PCR

1.2.5 茜素红染色：将iSCAP接种到24孔板中，第14天进行茜素红染色。弃旧培养基，清洗固定，加入茜素红染液，清洗，采集各组细胞染色后图像。

1.3 统计分析

数据均用SPSS 19.0软件包分析处理，使用单因素方差分析进行多组间比较，两组间比较使用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 BMP9可激活ERK5信号通路

Western blotting检测结果发现，4组的ERK5的总蛋白表达水平基本相同，而P-ERK5蛋白表达差异明显。P-ERK5蛋白表达水平BMP9组最强，而实验组则明显低于BMP9组，但高于对照组，提示BMP9可激活iSCAP中ERK5信号通路，且BIX02189明显抑制了BMP9诱导的P-ERK5的表达。见图1。

2.2 BIX02189可抑制早期成骨/成牙本质分化

ALP染色结果发现BMP9组ALP染色较其他3组深，实验组的ALP阳性染色与BMP9组相比明显减少，提示BIX02189可以抑制BMP9诱导的iSCAP早期成骨/成牙本质分化。见图2。

2.3 BIX02189可抑制成骨/成牙本质相关基因的表达

图2 BIX02189可抑制BMP9诱导的iSCAP的早期成骨分化Fig.2 Inhibitory effect of the ERK5 inhibitor BIX02189 on BMP9-induced early osteogenic differentiation of iSCAP

RT-PCR检测相关基因的表达，结果发现BMP9组的成骨/成牙本质相关基因Runx2、OPN、OCN和DMP1的表达水平最高，而实验组则明显低于BMP9组，提示BMP9诱导的成骨/成牙本质相关基因表达受到抑制。见图3。

2.4 BIX02189可抑制晚期成骨/成牙本质分化

图3 BIX02189可抑制BMP9诱导的相关成骨/成牙本质基因表达Fig.3 BIX02189 reduces BMP9-induced RUNX2 and target gene expression

茜素红染色结果发现BMP9组的钙盐沉积最多，染色效果最强；实验组钙盐沉积颗粒明显少于BMP9组，提示BIX02189能够抑制BMP9诱导iSCAP细胞晚期成骨/成牙本质分化。见图4。

图4 BIX02189可抑制BMP9诱导的钙盐沉积Fig.4 Inhibitory effect of BIX02189 on BMP9-induced calcium deposition

3 讨论

ERK5作为MAPK家族的一个新成员，分子结构有别于家族其他成员，且存在于转录激活区，可通过自身的磷酸化来调控转录过程，参与细胞的生物学活动［9］。研究［10］表明，特定条件流体剪切力能激活ERK5通路，诱导成骨细胞增殖和分化。耿雪静等［11］研究发现，BMP9可以通过ERK5信号通路诱导间充质干细胞分化成心肌样细胞。但是ERK5信号通路在BMP9促进iSCAP成骨/成牙本质分化过程中的具体作用机制尚不清楚。因此，本研究对其作用机制进行了初步研究。

首先，为了研究BMP9能否激活iSCAP细胞中的ERK5信号通路，本研究用Ad-BMP9感染iSCAP，Western blotting检测结果显示，BMP9可以增强PERK5表达，加入抑制剂的实验组P-ERK5蛋白的表达水平明显低于BMP9组，但高于对照组，而ERK5总蛋白表达没有明显变化，提示ERK5信号通路参与了BMP9诱导iSCAP成骨/成牙分化过程。为了进一步探索ERK5信号通路的作用机制，本研究组通过ALP染色，RT-PCR检测及茜素红染色进一步检测其成骨/成牙本质分化的变化。成牙本质细胞和成骨细胞均能够在一定条件下形成硬组织，也可以表达许多成骨/成牙本质相关基因，如Runx2、OPN、OCN、DMP1等［12］。Runx2是间充质干细胞向成骨细胞分化的重要标志［13］；OPN、OCN是成骨成熟的重要标志物［14-15］；DMP1则是形成牙本质和矿化过程中的重要非胶原基质蛋白，在骨组织和牙本质中都大量表达［16］。通过RT-PCR检测，证实BIX02189抑制ERK5通路后，BMP9诱导的相关成骨/成牙本质基因Runx2、OPN、OCN、DMP1转录表达水平均明显下调，并且BMP9诱导的ALP活性也明显降低，茜素红染色也显示钙盐沉积颗粒显著减少。通过一系列体外细胞实验证明抑制ERK5信号通路可抑制BMP9诱导iSCAP细胞的早/中/晚期成骨/成牙本质分化作用。

综上所述，本研究初步证实了BMP9可以通过激活ERK5信号通路促进iSCAP成骨/成牙本质分化的过程，其具体作用机制有待后续的体内实验进一步研究探索。

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（编辑 北辰）

BMP9 Regulates Osteogenic/Odontogenic Differentiation of Immortalized Stem Cells from the Apical Papilla via the ERK5 Pathway

KONG Lingjiao，WANG Jinhua

（Chongqing Key Laboratory of Oral Diseases and Biomedical Sciences，Stomatology Hospital of Chongqing Medical University，Chongqing Municipal Key Laboratory of Oral Biomedical Engineering of Higher Education，Chongqing 401147，China）

Objective The aim of this study was to investigate the effects of the ERK5 pathway on bone morphogenetic protein-9（BMP9）-regulated osteogenic/odontogenic differentiation of immortalized stern cells from the apical papilla（iSCAP）.MethodsBMP9 was introduced into the iSCAP by using recombinant adenoviruses，and the P-ERK5 protein expression was measured via western blotting.Then，the osteogenic/odontoblastic changes were analyzed by alkaline phosphatase（ALP）staining and Alizarin red staining，and the expression of osteogenic/odontoblast-associated genes，such asRunx2，OCN，OPN，andDMP1was measured by RT-PCR.ResultsBMP9 could up-regulate the phosphorylation of ERK5 in iSCAP.After using BIX02189，which was an inhibitor of ERK5，the phosphorylation of ERK5；the activity of ALP；the expression ofRunx2，OCN，OPN，andDMP1；and the calcium deposition were all significantly inhibited.ConclusionThe ERK5 signaling pathway plays an important role in BMP9-regulated osteogenic/odontogenic differentiation of iSCAP.

immortalized stern cells from the apical papilla；bone morphogenetic protein-9；ERK5；osteogenic/odontogenic differentiation

R78

A

0258-4646（2017）06-0527-05

10.12007/j.issn.0258-4646.2017.06.011

重庆市渝北区科研项目［2014（社）14号］；重庆高校创新团队建设计划（2016）

孔令姣（1988-），女，硕士研究生.

王金华，E-mail：dentistwjh@163.com

2016-07-06

网络出版时间：