膜联蛋白A1对糖尿病大鼠心功能及炎症反应的影响

陈建康，严瑜，潘晓莉，张泓，林帆，朱鹏立，柯俊

（福建省立医院，福建省医科大学省立临床医学院1.老年科，福建省临床老年病研究所；2.急诊内科，福建省急诊医学研究所，福州350001）

膜联蛋白A1对糖尿病大鼠心功能及炎症反应的影响

陈建康1，严瑜1，潘晓莉1，张泓1，林帆1，朱鹏立1，柯俊2

（福建省立医院，福建省医科大学省立临床医学院1.老年科，福建省临床老年病研究所；2.急诊内科，福建省急诊医学研究所，福州350001）

目的探讨膜联蛋白A1（Annexin A1）对糖尿病大鼠心功能及肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白细胞介素1β（IL-1β）的影响。方法将24只SD大鼠随机均分为正常对照组、糖尿病组；利用高糖高脂饮食饲养及较小剂量链脲佐菌素（30 mg/kg）诱导造成2型糖尿病模型，2组分别予以普通喂食、高糖高脂喂食；于第8周末用彩色多普勒超声检测左心室舒张末期容积（LVEDV）、左心室收缩末期容积（LVESV）、二尖瓣舒张早期峰值速度/二尖瓣舒张晚期峰值速度（e/a）比值、左心室射血分数（LVEF）、每搏射血量（SV）；第0、4、8周采用实时PCR测定血中Annexin A1表达，采用酶联免疫分析法测定血中TNF-α、IL-1β。结果与正常对照组对比，糖尿病组LVEDV、e/a、SV明显下降，Annexin A1明显上升（P＜0.05），8周后糖尿病组Annexin A1显著下降（P＜0.01）；与正常对照组对比，糖尿病组TNF-α、IL-1β上升明显（P＜0.05），8周后上升更明显（P＜0.01）；糖尿病组Annexin A1与TNF-α、IL-1β负相关（r分别为-0.73、-0.71，P＜0.01）。结论Annexin A1可改善糖尿病大鼠心功能，Annexin A1改善糖尿病大鼠心功能可能与炎症反应有关。

膜联蛋白A1；心功能；2型糖尿病；炎症反应

心脏功能改变与心肌病变密切相关，2型糖尿病导致的心肌病变是心力衰竭的重要原因之一，也是心血管病主要的死亡原因之一。目前认为2型糖尿病心肌病的发病机制与高血糖、氧化应激、炎症等有关。炎症反应在糖尿病心肌病中发挥重要的作用，它增强氧化应激使活性氧（reactive oxygen，ROS）增加，炎性细胞因子（TNF-α、IL-1β）分泌增多，炎症细胞（粒细胞/单核细胞）聚集及迁移，转化生长因子β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）分泌增多，造成心肌细胞肥大、间质纤维化、微血管病变，从而形成糖尿病心肌病变。已有研究［1-4］证实通过抑制炎症反应可以改善糖尿病心肌病变，从而达到改善心功能的目的。

膜联蛋白A1（Annexin A1）是体内重要的抗炎物质，与炎症反应、细胞分化和增殖、细胞迁移、细胞凋亡、信号调控、凋亡细胞吞噬清除等许多细胞生命活动有密切关系［5-6］。有报道［7］表明2型糖尿病伴肾功能不全患者血清中Annexin A1水平下降，Annexin A1在体内可能抑制糖尿病肾病的进展，但在糖尿病心脏病中Annexin A1的作用不明。本研究探讨Annexin A1对糖尿病大鼠心功能及炎症反应的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

近交系SPF级SD大鼠6周龄24只，体质量（200±10）g，由福建医科大学动物实验中心提供；链脲佐菌素（streptozocin，STZ）购于美国Sigma公司；兔抗大鼠TNF-α、IL-1β购于南京建成生物工程研究所；小动物超声多普勒（GE Healthcare），RNA提取试剂、引物、RT-PCR试剂盒购于大连宝生物公司；Annexin A1单克隆抗体购于美国Santa Cruz公司。

1.2 方法

1.2.1 分组和动物模型建立：大鼠随机分为对照组（12只）、糖尿病组（12只）。对照组不接受任何处理，釆用普通词料喂养；糖尿病组釆用高糖高脂饲料饲养。1个月后，糖尿病组大鼠一次性腹腔注射STZ（30 mg/kg），3 d后监测血糖，连续2 d血糖值均＞16.7 mmol/L认定造模成功，之后继续喂养8周。

1.2.2 超声多普勒检测心功能：8周末用水合氯醛麻醉大鼠，由心脏彩超室医生操作，采用小动物超声多普勒，探头频率为10 MHz，测量左心室舒张末期容积（left ventricular end-diastolic volume，LVEDV）、左心室收缩末期容积（left ventricular endsystolic volume，LVESV）、二尖瓣舒张早期峰值速度/二尖瓣舒张晚期峰值速度（e/a）比值、左心室射血分数（left ventricular ejection fraction，LVEF）、每搏射血量（stroke volume，SV）。

1.2.3 血液TNF-α、IL-1β检测：实验第0、4、8周按照试剂盒步骤采用酶联免疫分析法测定各组大鼠血中TNF-α、IL-1β水平。

1.2.4 实时PCR检测血液Annexin A1：实验第0、4、8周测定血中Annexin A1表达，按Trizol法提取总RNA，参照说明书对Annexin A1进行逆转录和PCR扩增，正反引物序列分别为5’-GCAATGAAGGAGA TAAG-3’和5’-ATTCCTCTTCAGTTC-3’，扩增长度分别为315 bp、327 bp，采用1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测，自动凝胶系统拍照，并进行图像分析。

1.3 统计学分析

所有数据用SPSS 19.0软件进行统计分析，数据采用x±s表示，组间比较采用t检验和单因素方差分析，多变量之间采用相关关系进行相关分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 对照组与糖尿病组心功能比较

与正常对照组比较，糖尿病组LVEDV、e/a、SV明显下降（均P＜0.05），LVEDV、LVEF略有下降，但无统计学差异（P＞0.05），见表1。

2.2 对照组与糖尿病组Annexin A1表达比较

与对照组比较，糖尿病组Annexin A1表达明显上升（P＜0.05），随着时间延长糖尿病组Annexin A1表达逐渐下降，8周后与对照组比较Annexin A1明显下降（P＜0.01），见表2。

表1 2组大鼠心功能指标比较（x±s）Tab.1Comparison of cardiac function between the control and diabetic groups

表1 2组大鼠心功能指标比较（x±s）Tab.1Comparison of cardiac function between the control and diabetic groups

1）compared with control group，P＜0.05.

GroupnLVEDV（mL）LVESV（mL）LVEF（%）e/aSV（mL）Control120.781±0.061 20.211±0.051 373.220±5.051 71.209±0.048 10.570±0.081 2 DM120.580±0.059 31）0.180±0.049 469.320±4.051 40.810±0.052 11）0.400±0.067 31）

2.3 对照组与糖尿病组炎症指标比较

与对照组比较，糖尿病组TNF-α、IL-1β水平升高（P＜0.05）；随着时间延长TNF-α、IL-1β水平逐渐上升，糖尿病组8周时上升更明显（P＜0.01），见表3。

2.4 Annexin A1与TNF-α、IL-1β的相关分析

糖尿病组大鼠Annexin A1表达与TNF-α、IL-1β相关分析结果显示，Annexin A1与炎症程度呈负相关（r分别为-0.73、-0.71，均P＜0.01），随着时间延长Annexin A1水平逐渐降低，而炎症指标逐步升高。

表2 2组大鼠Annexin A1表达比较Tab.2 Comparison of annexin A1 expression level between the control and diabetic groups

表2 2组大鼠Annexin A1表达比较Tab.2 Comparison of annexin A1 expression level between the control and diabetic groups

1）P＜0.05 compared with control group；2）P＜0.01 compared with control group.

Groupn Annexin A1 0 week4 weeks8 weeks Control120.28±0.0510.29±0.0440.30±0.046 DM120.44±0.0351）0.41±0.0670.21±0.0322）

表3 2组大鼠炎症指标比较（Tab.3Comparison of the inflammation index between the control and diabetic groups（）

表3 2组大鼠炎症指标比较（Tab.3Comparison of the inflammation index between the control and diabetic groups（）

1）P＜0.05 compared with control group；2）P＜0.01 compared with control group.

IL-1β 0 week4 weeks8 weeks0 week4 weeks8 weeks Control1223.28±5.0524.38±4.4528.53±5.3415.38±3.5316.82±4.2317.27±4.63 DM1244.54±6.671）68.23±6.781）87.56±7.672）28.58±5.451）38.26±4.781）50.83±7.572）GroupnTNF-α

3 讨论

2型糖尿病发病率高、并发症多，临床危害性极大。2型糖尿病与冠状动脉粥样硬化性心脏病、高血压、房颤、心力衰竭等心血管疾病密切相关，糖尿病可以诱发或者促进心力衰竭进展［8］。糖尿病导致的非缺血性心肌病是心力衰竭重要原因，临床上早期表现为心脏舒张功能障碍，晚期则主要表现为心脏收缩功能障碍［9］。目前研究认为，糖尿病发展过程中伴随炎症反应强度增加，而在糖尿病心肌病变过程中必然伴随着炎症反应的增强［10］。因此通过抑制炎症反应可能改善糖尿病心肌病变，从而进一步改善心功能。

Annexin A1是膜联蛋白超家族中第一个被发现的成员，又称依钙蛋白、磷脂酶A2抑制蛋白，依赖钙离子与细胞膜磷脂结合，表达于机体多数器官、组织，尤其是粒细胞/单核细胞中表达水平高。Annexin A1在体内具有强大抗炎作用，与炎症反应密切相关。既往Annexin A1研究多集中于感染、肿瘤等，近些年有研究［11-14］表明Annexin A1与动脉粥样硬化、冠状动脉粥样硬化性心脏病、脑梗死、肺肝纤维化等相关。TNF-α、IL-1β是主要由单核-巨噬细胞分泌的细胞因子，在炎症反应中起重要作用。

本研究探讨糖尿病大鼠血中Annexin A1表达以及其对心功能、TNF-α、IL-1β的影响。结果显示，糖尿病对大鼠心功能的影响主要以舒张功能障碍为主，符合早期糖尿病心肌病表现，这与既往研究结果一致［15-17］。糖尿病组大鼠实验开始Annexin A1表达上升明显，随着病程进展Annexin A1逐渐下降，说明在糖尿病初期体内存在炎症反应，Annexin A1增加发挥抗炎作用，糖尿病病情发展过程中，炎症反应强度增加，Annexin A1表达受到抑制。本研究结果显示糖尿病组大鼠心功能恶化，Annexin A1表达受到抑制，提示糖尿病心肌病变与Annexin A1有关，因此推测Annexin A1表达增加可能改善糖尿病大鼠心肌病变。同样，结果显示对照组大鼠Annexin A1和TNF-α、IL-1β随着时间延长变化不明显，但糖尿病组TNF-α、IL-1β随着时间的延长TNF-α、IL-1β逐渐升高，说明糖尿病病情发展过程伴随炎症反应的增强。Annexin A1发挥抗炎作用重要机制之一是抑制磷脂酶A2（phospholipase A2，PLA2），PLA2是炎症介质合成释放的关键酶，是调节炎症过程的中心，PLA2被抑制后，中性粒细胞表面整合素和脂多糖的表达受到抑制，从而抑制中性粒细胞分泌TNF-α、IL-1β。本研究发现Annexin A1与TNF-α、IL-1β呈负相关，提示随着时间的延长，Annexin A1受到抑制，炎症反应增强，进而说明糖尿病大鼠心功能减退与Annexin A1抑制、炎症反应增强相关。因此推测糖尿病大鼠通过内源性Annexin A1发挥抗炎作用，Annexin A1表达可改善糖尿病大鼠心肌病变。

本研究存在一定的局限性，无心肌组织样本及未检测心肌Annexin A1表达。拟开展后续实验，通过基因敲除Annexin A1、补充外源性Annexin A1进一步验证Annexin A1改善糖尿病大鼠心肌病变的作用。

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（编辑 武玉欣）

Effect of Annexin A1 on the Cardiac Function and Inflammatory Response of Diabetic Rats

CHEN Jiankang1，YAN Yu1，PAN Xiaoli1，ZHANG Hong1，LIN Fan1，ZHU Pengli1，KE Jun2

（1.Department of Geriatric Medicine，Fujian Institute of Clinical Geriatrics，Fujian Provincial Hospital，Provincial Clinical College，Fujian Medical University，Fuzhou 350001，China；2.Department of Emergency，Fujian Provincial Institute of Emergency Medicine，Fujian Provincial Hospital，Provincial Clinical College，Fujian Medical University，Fuzhou 350001，China）

Objective To study the effect of annexin A1 on cardiac function，tumor necrosis factor α（TNF-α），and interleukin 1β（IL-1β）in diabetic rats.MethodsTwenty-four SD rats were randomly divided into normal control and diabetic groups.The type 2 diabetes model was induced with a high-glucose and high-fat diet and administration of low-dose streptozotocin.Left ventricular end-diastolic volume（LVEDV），left ventricular end-systolic volume（LVESV），peak velocity of early diastolic mitral-to-late diastolic peak velocity（e/a）ratio，left ventricular ejection fraction（LVEF），and stroke volume（SV）were measured by using color Doppler ultrasonography at the end of week 8.The expression levels of TNF-α and IL-1β in blood were measured by using enzyme-linked immunosorbent assay，and the expression level of annexin A1 in blood was measured at weeks 0，4，and 8 by using real-time polymerase chain reaction.ResultsCompared with the normal control group，the diabetic group had decreased LVEDV，e/a，and SV（P＜0.05）.The annexin A1 expression level in the diabetic group decreased significantly after 8 weeks（P＜0.01）. The TNF-α and IL-1β levels in the diabetic group were significantly higher than those in the normal control group（P＜0.05）and increased significantly after 8 weeks（P＜0.01）.Annexin A1 level correlated with the TNF-α and IL-1β levels in the diabetic group（P＜0.01）.ConclusionAnnexin A1 expression shows an anti-inflammatory effect that improved the cardiac function of diabetic rats.

Annexin A1；cardiac function；type 2 diabetes；inflammation

R544.1

A

0258-4646（2017）06-0532-04

10.12007/j.issn.0258-4646.2017.06.012

福建省自然科学基金（2016J01431）

陈建康（1975-），男，副主任医师，硕士.

柯俊，E-mail：68223384@qq.com

2016-12-13

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