姜黄素联合顺铂对人舌鳞癌Tca-8113细胞的影响

佟周，刘长富，谭婧玉，王稚英

（锦州医科大学附属第二医院口腔颌面外科，辽宁锦州121001）

姜黄素联合顺铂对人舌鳞癌Tca-8113细胞的影响

佟周，刘长富，谭婧玉，王稚英

（锦州医科大学附属第二医院口腔颌面外科，辽宁锦州121001）

目的姜黄素或姜黄素联合顺铂在体外作用于人舌鳞癌Tca-8113细胞，观察其对人舌鳞癌细胞增殖的影响，并探讨可能的抗肿瘤作用机制。方法将培养的Tca-8113细胞随机分为姜黄素组、顺铂组、姜黄素联合顺铂组和对照组。MTT法检测各组药物对舌鳞癌Tca-8113细胞增殖的抑制作用；Hoechst 33258染色法观察各组药物对舌鳞癌细胞核的形态影响；流式细胞术检测细胞凋亡率；Western blotting检测各组药物对舌鳞癌Tca-8113细胞Notch1和表皮生长因子受体（EGFR）蛋白表达的影响。结果MTT法结果显示，姜黄素联合顺铂组抑制舌鳞癌Tca-8113细胞增殖的作用明显高于姜黄素组和顺铂组（P＜0.05）。流式细胞分析结果显示，姜黄素联合顺铂组的细胞凋亡率明显高于姜黄素组和顺铂组（P＜0.05）。Western blotting结果显示，与姜黄素联合顺铂组比较，姜黄素组和顺铂组Notch1表达明显上调，EGFR表达则明显下调，而姜黄素联合顺铂组对Notch1和EGFR表达调控的影响与姜黄素组和顺铂组相比差异有统计学意义（P＜0.05）。结论姜黄素与顺铂在抑制人舌鳞癌Tca-8113细胞增殖时具有协同效应，其机制可能与上调Notch1信号通路、下调EGFR信号通路有关。

姜黄素；顺铂；人舌鳞癌Tca-8113细胞；细胞凋亡；信号通路

口腔癌是头颈部最常见的恶性肿瘤，占全身恶性肿瘤的3%，舌鳞状细胞癌（tongue squamous cell carcinoma，TSCC）在口腔癌中的构成比最高，其发病率和死亡率在口腔颌面部恶性肿瘤中居首位［1］，尤其是TSCC晚期，肿瘤向肺部、纵膈等远处转移，常规的手术治疗、放疗、化疗效果均不理想［2］。以顺铂为代表的铂类化合物由于其显著的抗肿瘤作用，是治疗舌鳞状细胞癌过程中最常用的一类化疗药物，其通过与DNA单链内两点或双链发生交叉联结，抑制癌细胞的DNA复制过程，发挥肿瘤杀伤作用。但顺铂具有较强的细胞毒性，其不良反应以及耐药性严重限制了该类药物的使用［3］。

姜黄素是中药姜黄的一种活性成分，具有抗氧化、抗肿瘤、抗炎、清除自由基、抗微生物等多方面的药理作用。近年来，姜黄素抑制肿瘤增殖、促进肿瘤凋亡的作用越来越引起人们的重视。已有研究［4］证实，姜黄素可以诱导头颈部鳞状细胞癌的凋亡，但姜黄素联合顺铂是否具有协同作用尚不明确。本研究应用姜黄素联合顺铂作用于人舌鳞癌细胞，观察是否可以增强二者单独使用时诱导肿瘤细胞凋亡的作用，并结合相关信号转导通路的变化探讨可能的机制，为临床应用化疗药物治疗人舌鳞状细胞癌提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 细胞和试剂

人舌鳞状细胞癌细胞株（Tca-8113）购自中科院上海细胞生物研究所；姜黄素购美国Fluka公司；新生胎牛血清购自杭州四季青公司；顺铂购自齐鲁制药公司；MTT检测试剂盒、Hoechst 33258、Annexin VFITC流式检测试剂盒购自北京索莱宝公司；RPMI-1640培养液购自美国Sigma公司；一抗兔抗人Notch1多克隆抗体、表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）多克隆抗体、鼠抗人βaction抗体均购自美国Santa Cruz公司。

1.2 细胞培养

Tca-8113细胞在含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 U/mL链霉素的RPMI-1640培养液中培养，0.25%的胰蛋白酶消化传代，于体积分数为5% CO2、37℃的CO2培养箱中培养，每2～3 d传代1次，取对数生长期细胞用于实验。

1.3 实验分组

实验分为4组：姜黄素组，用含终浓度为40 μmol/L姜黄素的培养液培养细胞48 h；顺铂组，用含终浓度为4 μg/mL顺铂的培养液培养细胞48 h；姜黄素联合顺铂组，用含终浓度为40 μmol/L姜黄素和4 μg/mL顺铂的培养液培养细胞48 h；对照组，RPMI-1640培养液培养细胞48 h。

1.4 MTT法检测细胞增殖抑制率

将Tca-8113细胞制成单细胞悬液，调整细胞密度，按照5×104/孔接种到96孔板中，每孔体积100 μL，培养板的边缘孔加入等量无水PBS，设置空白对照孔。将96孔板置于恒温37℃、5%CO2培养箱中培养，待细胞贴壁后，去除旧的培养液，按照实验分组，每孔更换对应培养液100 μL置于CO2培养箱中培养48h，各组细胞处理结束前4h每孔加入5mg/mL的MTT 10 μL，将孔内培养上清液吸弃后，每孔加入150 μL DMSO，震荡10 min，使蓝色结晶物充分溶解。在酶标仪上测定492 nm处的吸光值（A值）。细胞增殖抑制率（%）=（1-处理组A值/对照组A值）×100%［5］。

1.5 Hoechst 33258荧光染色法观测细胞核形态变化

选取对数生长期的Tca-8113细胞接种于6孔板中，置37℃、5%CO2培养箱中培养过夜，按照实验分组处理各组细胞48 h后，用PBS冲洗各孔3次，以4%多聚甲醛固定10 min，按照Hoechst 33258试剂盒的操作步骤进行染色，荧光显微镜下观察，随机选取10个视野拍照［6］。

1.6 流式细胞术检测细胞凋亡率

将Tca-8113细胞接种于12孔板中，待细胞贴壁后，按照实验分组处理各组细胞48 h后，用0.25%的胰酶消化并吹打制成单细胞悬液，4℃预冷的PBS洗细胞2次后，重悬细胞于250 μL结合缓冲液中，调节浓度至1×109/L，吸取100 μL的细胞悬液于5 mL流式管中，加入5 μL Annexin V/FITC和10 μL碘化丙锭（20 μg/mL）溶液，混匀后于室温避光孵育15 min，在反应管中加400 μL PBS，上流式细胞仪分析［7］。

1.7 Western blotting检测Notch1和EGFR表达情况

各组细胞处理结束后，用冰PBS缓冲液洗细胞2次，然后加细胞裂解液并低温放置20 min，再以12 000 r/min、4℃离心20 min，收集上清液进行定量分析。取50 μg已定量的总蛋白进行12%SDSPAGE实验，电转移至硝酸纤维素膜上，再用5%脱脂奶粉封闭过夜，加入1∶500稀释的一抗Notch 1、EGFR、β-action室温孵育3 h，TBS溶液洗涤后加入1∶4 000稀释的二抗，室温孵育1.5 h；TBS溶液再次洗涤后经化学发光试剂孵育，发光，显示实验结果［8］。

1.8 统计学分析

2 结果

2.1 细胞增殖抑制率

与对照组相比，姜黄素组和顺铂组的细胞生长抑制率均明显升高（P＜0.05），而姜黄素联合顺铂组的细胞生长抑制率与顺铂组和姜黄素组相比明显升高（P＜0.05）。见表1。

2.2 Hoechst 33258荧光染色法观测细胞核形态变化

荧光显微镜下可见对照组的细胞核边缘光滑整齐，呈蓝色；顺铂组和姜黄素组以及姜黄素联合顺铂组的细胞核固缩、边缘不整齐，呈碎块状致密浓染，甚至可见裂解的细胞核，呈典型的凋亡特征性改变。见图1。

表1 细胞增殖抑制率、细胞凋亡率和蛋白表达情况的比较Tab.1 Comparison of cell proliferation inhibition rate，apoptosis rate，and protein expression in different groups

图1 Hoechst 33258荧光染色法观测细胞核形态变化×200Fig.1 Morphological changes of the nucleus by Hoechst 33258 fluorescence staining×200

2.3 细胞凋亡率

与对照组相比，姜黄素组和顺铂组的细胞凋亡率明显高于对照组（P＜0.05），而姜黄素联合顺铂组的细胞凋亡率与姜黄素组和顺铂组相比明显升高（P＜0.05）。见表1、图2。

2.4 Notch1和EGFR表达情况

与对照组相比，姜黄素组、顺铂组、姜黄素联合顺铂组Notch 1蛋白表达均明显上调（P＜0.01），而EGFR蛋白表达明显下调（P＜0.01），与姜黄素组、顺铂组相比，姜黄素联合顺铂组Notch 1和EGFR的表达变化更为明显（P＜0.01）。见表1、图3。

3 讨论

Notch信号通路由受体、配体和DNA结合蛋白组成，哺乳动物中有4个Notch同源受体和5个同源配体，Notch 1受体是4个同源受体中的一种，属于Ⅰ型跨膜蛋白，由胞内区、跨膜区和胞外区组成，胞内区包含一个N端RAM结构域，胞内区负责将Notch信号转到细胞核内，胞外区有29～36个表皮生长因子样重复序列，其中第11、12个表皮生长因子样重复序列介导与配体的相互作用，Notch 1不仅对正常细胞分化起重要作用，而且与一些肿瘤的发生和发展密切相关［9］，目前研究显示，Notch 1在不同肿瘤乃至同一肿瘤中起着不同甚至相反的作用。有研究［10］表明，在口腔鳞状细胞癌的发生发展过程中，活化的Notch 1信号主要起增殖抑制和凋亡诱导的作用。本研究中流式细胞术结果显示，与单独应用姜黄素和顺铂相比，联合应用二者对Tca-8113细胞有更好的诱导凋亡作用，而Western blotting的结果提示，这可能是通过上调Notch 1蛋白的表达实现的。

图2 流式细胞术分析细胞凋亡率Fig.2 Cell apoptosis rate assayed by flow cytometry

图3 Western blotting法检测Notch1和EGFR的表达情况Fig.3 Detection of Notch1 and EGFR protein expression by Western blotting

EGFR属跨膜糖蛋白，具有酪氨酸蛋白激酶活性，主要表达于基底层，维持角质形成细胞的未分化状态，其在基底层以上的细胞层中下调，EGFR信号通路在舌鳞状癌等角质形成来源的肿瘤中持续激活，促进癌细胞增殖［11］。在姜黄素联合顺铂作用Tca-8113细胞48 h后，细胞增殖抑制率显著增加（P＜0.05），EGFR表达下调。说明姜黄素联合顺铂的抗舌鳞状细胞癌的作用很可能是通过调节Notch和EGFR 2条信号通路的活化水平来实现的。有研究指出，在皮肤癌中，Notch1是p53的靶基因，EGFR信号通路通过下调p53基因的转录而负向调控Notch 1基因的表达，从而抑制癌细胞的增殖［12］。至于在人舌鳞癌细胞中Notch 1和EGFR之间是否存在交互作用，以及具体的相互作用途径，将是下一步研究的重点。

［1］YU J，XIE F，BAO X，et al.mir-300 inhibits epithelial to mesenchymal transition and metastasis by targeting Twist in human epithelial cancer［J］.Mol Cancer，2014，13（1）：69-74.DOI：10.1186/1476-4598-13-121.

［2］杨惠铃，李继功，温宁.上皮间质转化参与口腔鳞状细胞癌侵袭转移机制的研究进展［J］.中华老年口腔医学杂志，2015，13（6）：352-354.DOI：10.3969/j.issn.1672-2973.2015.06.009.

［3］李洪敏，袁芃，于典科，等.DNA修复基因RAD52遗传变异与小细胞肺癌铂类药物化疗疗效的关系［J］.中华肿瘤杂志，2016，38（7）：504-509.DOI：10.3760/cma.j.issn.0253-3766.2016.07.005.

［4］XI Y，GAO H，CALLAGHAN MU，et al.Induction of BCL2-interacting killer，BIK，is mediated for anti-cancer activity of curcumin in human head and neck squamous cell carcinoma cells［J］.J Cancer，2015，6（4）：327-332.DOI：10.7150/jca.11185.eCollection 2015.

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（编辑 陈姜）

Effect of Curcumin Combined with Cisplatin on Human Tongue Squamous Cell Carcinoma Tca-8113 Cells

TONG Zhou，LIU Changfu，TAN Jingyu，WANG Zhiying

（Department of Oral&Maxillofacial Surgery，The Second Affiliated Hospital，Jinzhou Medical University，Jinzhou 121001，China）

Objective To observe the effect of curcumin combined with cisplatin on the proliferation of human tongue squamous cell carcinoma Tca-8113 cells，and explore the possible mechanism of their anti-tumor effect in vitro.MethodsIn this study，the samples were divided into four groups:curcumin，cisplatin，curcumin combined with cisplatin，and control.Detection of rate of inhibition of Tca-8113 cell proliferation was carried out by MTT assay.This was followed by observation of the morphological changes of the nuclei by Hoechst 33258 fluorescence staining.Subsequently，cellular apoptosis was assayed by flow cytometry，and expression of Notch1 and epidermal growth factor receptor（EGFR）was examined by Western blotting.ResultsResults of MTT assay showed that curcumin combined with cisplatin inhibited the proliferation of tongue squamous cell carcinoma to a greater extent than either curcumin or cisplatin alone（P＜0.05）.Flow cytometry analysis indicated that，unlike curcumin or cisplatin alone，curcumin combined with cisplatin noticeably induced apoptosis（P＜0.05）.Results of Western blotting revealed that the expression of Notch1 was upregulated，whereas the expression of EGFR was downregulated to a greater extent in the control group than in cells treated with curcumin or cisplatin alone.Unlike curcumin and cisplatin groups，the combined group revealed statistically significant expressions of Notch1 and EGFR（P＜0.05）.ConclusionCurcumin and cisplatin have a combined effect on inhibition of proliferation of human tongue squamous cell carcinoma Tca-8113 cells.The mechanism may be related to upregulation of the Notch1 signaling pathway and downregulation of the EGFR signaling pathway.

curcumin；cisplatin；human tongue squamous cell carcinoma Tca-8113 cells；cell apoptosis；signal pathway

R782

A

0258-4646（2017）06-0552-05

10.12007/j.issn.0258-4646.2017.06.017

佟周（1987-），女，硕士研究生.

王稚英，E-mail：bdwzy@126.com

2016-09-26

网络出版时间：