秋刀鱼鱼露速酿加工工艺研究

白政泽,翁佩芳,张 鑫,吴祖芳

(宁波大学海洋学院,浙江宁波 315211)



秋刀鱼鱼露速酿加工工艺研究

白政泽,翁佩芳*,张 鑫,吴祖芳

(宁波大学海洋学院,浙江宁波 315211)

为了研究鱼露快速发酵生产工艺,以秋刀鱼为原料,采用加曲适量保温的方式生产鱼露,通过单因素实验探讨不同因素(发酵周期、温度、固液比、加盐量、加曲量)对鱼露发酵生产的影响,并在此基础上进行正交实验工艺优化,结果表明,在发酵周期30 d时,鱼露发酵液中氨基酸态氮含量维持稳定,表明鱼肉组织基本分解完全,最佳发酵工艺条件为:温度30 ℃、固液比1∶0.6、加曲量5%、加盐量12%。在此条件下制得的鱼露氨基酸态氮含量(0.97±0.02) g/100 mL,可溶性固形物含量23%±0.51%,感官评分88分，鱼露颜色棕红至橙红,无异味,富有鱼露特殊香气,达到快速生产鱼露目的。

秋刀鱼,鱼露,速酿,工艺

鱼露,又叫鱼酱油,是东南亚地区普遍使用的一种调味品,在中国,以广东和福建生产居多。鱼露是以低值水产品以及生产加工中产生的水产品下脚料为原料,在酶及微生物的作用下,经过一系列复杂的生理生化反应发酵而成。鱼露风味物质包括酸、含硫化合物、羰基化合物、含氮化合物,这些物质的形成过程主要包括脂肪氧化、Maillard反应和Strecker降解等[1]。鱼露营养丰富,富含所有的人体必需氨基酸,在作为调味品的同时,也可对氨基酸进行一定量的补充,此外还含有大量生物活性肽[2]、牛磺酸、钙、碘等多种矿物质和维生素,具有降血压、抗氧化、降低胆固醇等功能特性[3-5]。鱼露的传统生产,通常采用“日晒夜露”的方式,由于添加了大量的食盐(一般为20%～30%)[6],较高的盐度对内源性蛋白酶和微生物生命活动产生抑制作用,其生产周期较长,一般为1～2年[7],此外,鱼露开放式的发酵环境,也使其产品质量不易控制。虽然传统鱼露生产方式简单,但储存空间大、周期长的特点限制了其规模化发展。

秋刀鱼主要分布于北太平洋温带海域,其生命周期短,生长迅速,资源丰富[8]。鱼露的生产主要以鳀鱼为原料[9-10],部分以水产品下脚料为原料[11-13],对于以秋刀鱼为原料生产鱼露尚未见报道。米曲霉(Aspergillusoryzae)是一种好氧性微生物,其培养条件简单粗放、生长迅速、抗杂菌能力较强。米曲霉分泌的酶系复杂,其中蛋白酶、淀粉酶活力较高,并且有一定的谷氨酰胺酶活力,是生产酱油制品常用的的菌种[14]。在人工控制条件下,利用微生物快速发酵技术,通过工艺技术研究将秋刀鱼加工成营养丰富的鱼露,不但为秋刀鱼的利用开辟了一条新途径,在一定程度上可提高秋刀鱼的加工价值,减少鱼类加工废弃物对环境的污染以及冷链储存的能源消耗,而且为鱼露生产增加了新的原料品种,同时可以满足国内外市场对调味品的需求,具有重要的经济和社会意义。

本文以秋刀鱼为原料,选用豆粕、麸皮作为培养基制备米曲霉成曲,在单因素基础上进行正交优化实验,通过工艺优化,在保证鱼露品质的前提下,加快鱼露发酵速率,为企业生产鱼露产品提供理论依据和方法指导。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

冷冻秋刀鱼 浙江舟山兴业公司;酱油曲精(米曲霉沪酿3.042) 上海佳民酿造食品有限公司;豆粕、麸皮、食盐 市售;PDA培养基 杭州微生物试剂有限公司;其他化学试剂 均为分析纯。

PHS-3C型pH计 上海圣科仪器设备有限公司;DHG-9140AS电热恒温鼓风干燥箱 宁波江南仪器厂;TE214S分析天平 成都浩驰仪器有限公司;XPX智能型生化培养箱 宁波江南仪器厂;SW-CJ-2D型超净工作台 苏州净化设备有限公司;KDN-08消化炉 上海新嘉电子有限公司;LDZX-40B I型立式蒸汽灭菌器 上海申安医疗器械厂;5804R高速大容量冷冻离心机 德国Eppendorf公司;ZYD-F92手持式折光仪 北京智云达科技股份有限公司;MGH-90电动绞肉机 佛山名健电器制造有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 原料前处理 冷冻秋刀鱼先用流水解冻,沥干水分,然后用绞肉机绞碎后,除去少量可见油脂(油脂可用作开发鱼油等更高价值的产品),装入发酵坛,按各组实验要求添加对应含量的食盐,搅拌均匀,室温下盐渍2 d,备用。

1.2.2 种曲的制备 将酱油曲精划线接入PDA平板培养基,30 ℃下静置培养,挑取长势良好的菌落,划线接入斜面培养基,30 ℃培养,待长出黄绿色孢子后,4 ℃冰箱冷藏储存。

将麸皮、水按1∶1的比例加入到250 mL锥形瓶中,堆积厚度约2～3 cm,用玻璃棒搅拌均匀,121 ℃灭菌20 min,冷却后,接入3～5环米曲霉,30 ℃通风培养48～72 h,其间轻微摇晃锥形瓶翻曲2次,防止烧曲。待出现明显的肉眼可见的黄绿色微小颗粒时,种曲成熟。

1.2.3 成曲的制备 将豆粕、麸皮、水按6∶4∶5的比例加入500 mL锥形瓶中,经灭菌冷却后加入0.3%(w/w)的种曲,混合均匀,30 ℃静置通风培养,中间摇瓶翻曲两次,48～72 h制成成曲,成熟时为黄绿色。

1.2.4 鱼露样品制备 不同实验组将预处理好的鱼肉与成曲、盐、水按比例混合,然后发酵。取50 mL发酵鱼露酱醅,利用高速冷冻离心机离心(10000×g,4 ℃)10 min,将获得的中层清液取出,再次离心(10000×g,4 ℃)10 min、过滤,去除发酵不完全的蛋白质和其他杂质,制备成鱼露样品。

1.2.5 秋刀鱼鱼露发酵单因素实验

1.2.5.1 鱼露发酵周期的确定 在加曲量4%、加盐量10%、固液比1∶0.6、温度30 ℃条件下,进行鱼露发酵,以发酵液样品中氨基酸态氮含量为指标考察鱼露最佳发酵周期。

1.2.5.2 发酵温度对鱼露发酵的影响 设定25、30、35、40、45 ℃五个温度,在加曲量4%、加盐量12%、固液比1∶0.6条件下发酵30 d,以发酵液样品中氨基酸态氮含量为指标考察温度对鱼露发酵的影响。

1.2.5.3 加盐量对鱼露发酵的影响 分别加入8%、10%、12%、14%、16%的食盐,在加曲量4%、固液比1∶0.6、温度30 ℃条件下发酵30 d,以发酵液样品中氨基酸态氮、挥发性盐基氮(TVB-N)含量(盐度高低对于产品好坏有重要作用,加入评价水产品质量的指标来加以限定)为指标考察加盐量对鱼露发酵的影响。

1.2.5.4 固液比对鱼露发酵影响 设定固液比1∶0.2、1∶0.4、1∶0.6、1∶0.8、1∶1,在加曲量4%、加盐量12%、温度30 ℃条件下进行鱼露发酵,以发酵液样品中氨基酸态氮含量为指标考察固液比对鱼露发酵的影响。

1.2.5.5 加曲量对鱼露发酵影响 分别添加1%、3%、5%、7%、9%的成曲,在加盐量12%、固液比1∶0.6、温度30 ℃条件下进行鱼露发酵,以发酵液样品中氨基酸态氮含量为指标考察加曲量对鱼露发酵的影响。

1.2.6 鱼露发酵正交优化 在单因素基础上，以加盐量、固液比和加曲量为因素，以氨基酸态氮含量和感官评分为指标综合评价，设计L9(33)实验以确定发酵工艺的最佳条件。

表1 正交实验因素水平表Table 1 Factors and levels table of orthogonal experimeng

1.3 测定方法

1.3.1 原料成分测定 蛋白质含量测定采用国家标准GB 5009.5-2010;粗脂肪含量的测定采用国家标准GB/T 14772-2008;水分含量的测定采用国家标准GB 5009.3-2016;总灰分测定采用国家标准GB 5009.4-2016。

1.3.2 鱼露理化指标测定 氨基酸态氮(AA-N)测定:甲醛滴定法;全氮:凯氏定氮法;可溶性固形物含量:折射仪法;挥发性盐基氮(TVB-N):半微量定氮法;pH:采用数字式pH计测定。

1.3.3 感官分析 感官分析方法参照Jiang等[15],感官评定小组由10名具有食品感官评定经验的成员组成(5男5女,年龄在20～45岁),在感官评定前,先多次进行风味描述的一致认定和培训。感官评价时,取10 mL 鱼露样品在室温下静置20 min,对每个样品的风味特征(色泽、气味、口感、组织状态)进行评分。采用100分制,具体标准如表2所示。

表2 鱼露感官评分表Table 2 Sensory evaluation standard of fish sauce

1.3.4 数据处理 每个样品平行测定三次,所有数据采用SAS 8.1软件分析,用ANOVA进行方差分析,显著性检验方法为邓肯单因子多重比较分析,检测限为0.05,并用OriginPro 9.0作图。

2 结果与分析

2.1 原料成分测定

秋刀鱼的主要成分测定结果见表3。

表3 秋刀鱼的主要成分及质量分数(%)Table 3 The main components and mass fraction of saury(%)

由表3可知,新鲜秋刀鱼的水分含量较高,为60.02%,粗蛋白含量和粗脂肪含量分别为20.15%和18.81%左右。由此可见,秋刀鱼属于一种高蛋白高脂肪的鱼类,经一定的脱脂处理后可作为鱼露生产的良好原料。

2.2 鱼露单因素实验

采用单因素实验对鱼露发酵的温度、时间、固液比、加曲量、加盐量等进行研究,初步确定各个因素大致范围。

2.2.1 鱼露发酵周期的确定 传统鱼露生产主要是酶和微生物共同作用下的结果,鱼露的发酵受多种因素影响,其中,温度、盐分、酶等因素对发酵速率有显著影响。鱼露样品中氨基酸态氮含量随时间变化结果如图1所示。

图1 鱼露发酵过程中氨基酸态氮含量变化Fig.1 Change of amino nitrogen in fish sauce during fermentation

由图1可以看出,在一定时间内,随着发酵时间的延长,发酵液中氨基酸态氮含量逐渐上升,前20 d发酵较快,鱼肉分解较迅速,氨基酸态氮含量也相应上升较明显,到第25 d时,发酵液中氨基酸态氮含量达到0.91 g/100 mL,30 d时,氨基酸态氮含量为0.931 g/100 mL,发酵液中氨基酸态氮含量基本稳定,表明鱼肉已基本分解完全,鱼露初步发酵已经完成,后续实验则以此为依据,选择30 d作为发酵周期。

2.2.2 发酵温度对鱼露发酵的影响 鱼露发酵过程中,温度是一个非常重要的因素,温度对于酶和底物的结合、酶的最大反应速率(Vmax)、酶和底物分子解离基团的解离常数(pK),酶与激活剂、抑制剂或辅酶的结合等都有影响[16]。温度过高或者过低都会影响鱼露发酵反应的进行。温度对鱼露发酵的影响结果见图2。

图2 发酵温度对鱼露发酵的影响Fig.2 Effect of temperature on characteristic of fish sauce during fermentation

由图2及发酵过程中的感官变化可知,在25 ℃时,鱼露发酵缓慢,发酵30 d时,氨基酸态氮含量仅有0.61 g/100 mL左右,表明鱼肉未完全分解,可能是因为低温抑制了蛋白酶的活性而导致发酵不完全;在45 ℃时,经发酵30 d后,氨基酸态氮含量为0.749 g/100 mL,但其含量低于30、35、40 ℃三个温度下的氨基酸态氮含量,可能是温度在超过40 ℃以后,米曲霉生长受到抑制,使发酵总酶量下降,也可能是由于部分蛋白酶在较高温度下,蛋白酶稳定性降低,无法持续发挥作用;在30、35、40 ℃三个温度下,经30 d发酵,氨基酸态氮含量相差不大,基本都在0.9 g/100 mL以上。对35 ℃和40 ℃ 保温发酵的鱼露进行感官分析得知,虽然发酵时间小于30 d鱼肉即可完全分解,但在此温度下进行发酵,鱼露产品颜色变深,并带有焦糊味等不良风味,鱼露本身的鲜味被掩盖。一方面,发酵所用的酱油曲中本身可能带有部分淀粉成分,使Maillard反应加快,导致鱼露的颜色加深,另一方面,发酵液中的不饱和脂肪酸被氧化后会有炙烤感等不良的风味,所以35 ℃和40 ℃两个温度不适用于鱼露的加曲发酵,最佳发酵温度应为30 ℃。

传统酱油发酵采用的是“日晒夜露”,本质上是一种利用天然微生物所进行的多菌种常温平衡发酵方法,之所以选用常温,是因为常温发酵温度适宜,过高的温度虽然能抑制腐败微生物的生长,但是也破坏了多数有益微生物的生长代谢平衡,甚至使微生物死亡、酶活性丧失;过低的温度,虽然酶和微生物得到保留,但是其作用缓慢,使发酵时间大大延长。加曲发酵对于温度的要求更高,既要考虑发酵速度,又要平衡产品质量,所以后续实验选择30 ℃作为发酵温度。

2.2.3 加盐量对鱼露发酵的影响 加盐量是鱼露发酵过程中重要的因素,盐度对于微生物和酶的作用都会有重要影响,添加一定量的食盐,可以抑制腐败杂菌生长,同时也可以使鱼露具有一定的口感。加盐量对鱼露发酵影响结果见图3。

图3 加盐量对鱼露发酵的影响Fig.3 Effect of salt amount on characteristic of fish sauce during fermentation

在自然发酵过程中,为了防止腐败微生物的繁殖所带来的产品腐败问题,通常采用高盐盐渍的方法,高盐虽然对腐败微生物的繁殖产生抑制,却同时也抑制了蛋白酶的作用。由图3可知,随着加盐量的增加,鱼露氨基酸态氮、挥发性盐基氮含量都呈下降的趋势,食盐会抑制发酵反应的速率。在加盐量为8%时,鱼露腐败现象严重,TVB-N值达到279.15 mg/100 mL,有明显的臭味;在加盐量为10%时,虽然臭味不明显,但是其TVB-N含量也较高,达到205 mg/100 mL。较低的加盐量虽能使鱼露有较高的氨基酸态氮,但其挥发性盐基氮也会相应增高,总体感官品质较差,而且口感、风味不能被接受,因此确定盐度12%、14%、16%为后续优化实验条件,以期既能够进一步获得蛋白酶作用的适宜条件,同时又能抑制腐败微生物的繁殖,达到缩短发酵周期的目的。

2.2.4 固液比对鱼露发酵的影响 底物浓度对于发酵液中氨基酸态氮含量有重要影响,不同的底物和液体比例能够影响酶和底物的接触程度。固液比对鱼露发酵影响结果见图4。

图4 固液比对鱼露发酵的影响Fig.4 Effect of solid-liquid ratio on characteristic of fish sauce during fermentation

由图4可知,鱼露在不同固液比条件下发酵速率有显著不同,固液比为1∶0.2时,虽然氨基酸态氮含量最高,但发酵液较浓稠,经较长时间分解,仍有大量未分解的鱼肉,实验操作不易进行;在固液比1∶0.4时,发酵醪液也过于浓稠,鱼肉分解不完全,说明底物浓度越大越不利于酶解。其原因可能是因为鱼露发酵反应是在水溶液环境中进行的,在反应中水有利于分子的运动和扩散,底物与酶分子中特定的活性部位结合,形成不稳定的中间产物。当底物浓度过高时,随着反应的进行,过量的中间产物阻止了酶与底物的充分接触,就会使酶的分解反应速率降低。但是底物浓度也并不是越低越好,底物浓度过低会使发酵液中产生的氨基酸态氮等成分含量过低,而且在以后的加工处理过程中还要进行特定的工序处理,比如浓缩、干燥等,必然会使工艺变得复杂,后期成本增加。在后续的发酵实验中选择固液比1∶0.6、1∶0.8、1∶1进行正交优化实验。

2.2.5 加曲量对鱼露发酵的影响 制曲过程中米曲霉会产生复杂的酶系,其中包含大量的蛋白酶,对于鱼肉蛋白的分解有重要影响,加曲量对鱼露发酵影响结果见图5。

图5 加曲量对鱼露发酵的影响Fig.5 Effect of soy sauce song amount on characteristic of fish sauce during fermentation

由图5可知,加曲量越高,发酵反应越快,加曲量为1%时,经30 d发酵,氨基酸态氮含量为0.72 g/100 mL,含量较低,发酵液也没有香味;加曲量超过5%时,发酵液中氨基酸态氮含量基本不再上升,表明5%左右的成曲中含有的酶量已能基本满足发酵需求。通过感官评价可知，添加过多的曲可能会使发酵产品中曲味浓重,有过多的酱香味,掩盖了鱼露本身的鲜味。后续实验选择加曲量3%、5%、7%进行正交实验。

2.3 鱼露发酵正交实验

为了进一步优化鱼露发酵工艺,在单因素实验的基础上,确定发酵周期为30 d、温度30 ℃条件下,对加曲量、加盐量、固液比这三个因素进行L9(33)正交优化实验。正交实验发酵结果见表4、表5,方差分析见表6。

表4 鱼露发酵条件正交实验表Table 4 Orthogonal test results of fish sauce during fermentation

表5 鱼露发酵正交实验结果分析Table 5 Orthogonal experiment result analysis of fish sauce during fermentation

表6 正交实验方差分析Table 6 Orthogonal experiment of variance analysis

注:F0.05(2,2)=19. 000,F0.01(2,2)=99. 000,** 表示在p<0. 01差异极显著,* 表示在p<0. 05差异显著。

表7 鱼露产品理化指标Table 7 Physical and chemical index of fish sauce

以氨基酸态氮为指标的方差分析表明,固液比对鱼露的氨基酸态氮含量有极显著影响(p<0. 01),加盐量对氨基酸态氮有显著影响(p<0.05),而加曲量对氨基酸态氮的影响不显著,各因素的主次关系为C>B>A,分析得出的最优方案为A3B1C1;以感官评分为指标的方差分析表明,加曲量对鱼露的感官评分有极显著影响(p<0.01),固液比对感官评分有显著影响(p<0.05),而加盐量对感官评分的影响不显著,各因素的主次关系为A>C>B,分析得出的最优方案为A2B3C1。由于氨基酸态氮含量和感官评分两个指标的最优条件并不一致,因此采取综合平衡法[17]综合考虑发酵条件对指标的影响。加曲量在氨基酸态氮的分析中为次要因素,5%和7%的加曲量对于氨基酸态氮含量变化影响不大,但是加曲量在感官评分中为主要因素,5%的加曲量对于感官评分有较好的影响,综合分析得出鱼露发酵的最优工艺条件为A2B1C1,即加曲量5%,加盐量12%,固液比1∶0.6。

2.4 验证实验

在最优工艺条件下,平行制作一批鱼露产品,所得鱼露样品理化指标见表7。所得鱼露产品色泽棕红至橙红色,质地澄清,富有一定的光泽,无腐败臭味,具有鱼露特殊香气,各项理化指标符合国家标准。由此可见,通过正交实验优化确定的工艺能有效改善鱼露的品质。

3 结论

从总体上来看,虽然多数鱼露工艺优化以氨基酸态氮含量可以有效地优化出工艺条件,但是从实际应用上来看,单独以氨基酸态氮含量为指标的发酵工艺并不能很好的协调产品质量与风味的关系。以氨基酸态氮含量和感官值这两个指标同时作为目标输出值综合平衡优化鱼露发酵工艺条件,所优化出的工艺条件将更为科学,更具广阔的实用性。

在兼顾质量、风味、缩短生产周期前提下通过单因素实验、正交优化实验,确定了以秋刀鱼为原料的鱼露发酵工艺。得到的最佳发酵条件为发酵周期30 d、温度30 ℃、固液比1∶0.6、加曲量5%、加盐量12%,在此条件下制得的鱼露氨基酸态氮含量为(0.97±0.02) g/100 mL,可溶性固形物含量23%±0.51%,产品均一稳定,澄清透明,具有一定的香味,生产周期相比自然发酵显著缩短。将现代生物技术与传统鱼酱油生产工艺相结合,利用米曲霉高产蛋白酶的特性生产鱼酱油制品,克服了传统工艺生产周期长的特点,可以为秋刀鱼的加工利用提供一条新的途径,对以其他品种的低值水产品为原料开展鱼露的速酿生产亦具有借鉴意义。

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Study on brew processing of saury fish sauce by accelerating fermentation

BAI Zheng-ze,WENG Pei-fang*,ZHANG Xin,WU Zu-fang

(School of Marine Science,Ningbo University,Ningbo 315211,China)

In order to study the processing technology of accelerating fermentation,a fish sauce production was studied with saury as raw material,by adding koji and temperature keeping. Single factor experiment is adopted to investigate the effects of different factors(fermentation period,temperature,solid-to-liquid ratio,dosage of salt,components of koji)on production of fish sauce fermentation. And based on it,orthogonal experimental design was applied. The results showed that at the 30th day,the fish body was almost completely decomposed,the optimum conditions were as follows,temperature 30 ℃,solid-liquid ratio 1∶0.6,koji 5% and salt 12%. The content of amino nitrogen reached(0.97±0.02) g/100 mL under such a condition,and the content of soluble solids was 23%±0.51%,sensory score was 88. The color of fish sauce was from red to orange,with good aroma and no terrible flavor. Therefore,the objective of speed fermentation of fish sauce production was obtained.

saury;fish sauce;accelerated fermentation;technology

2016-11-07

白政泽(1988-)，男，硕士研究生，研究方向：水产品精深加工与贮藏，E-mail：zzbai2010@163.com。

*通讯作者:翁佩芳 (1963-)，女，大学本科，教授，研究方向：水产品精深加工与贮藏，E-mail：wengpf@hotmail.com。

国家级星火计划项目(2015GA700089)；浙江省水产重中之重开放基金资助项目(XKZSC1535)。

TS254.1

A

1002-0306(2017)10-0167-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.10.024