不明原因不孕患者子宫内膜种植窗口期IL-1β、IL-1ra mRNA的表达

柴 丹，王祥珍

(深圳市南山区妇幼保健院，广东 深圳 518000)

不孕症是妇科常见病之一，多数病人经过标准检查程序能明确病因，但仍有10%～20%患者至今未能找到确切病因[1]，称之为不明原因不孕症。良好的子宫内膜容受性和胚胎植入能力是决定胚胎成功着床的两大关键因素[2]。多种细胞因子参与子宫内膜容受性的建立，细胞因子表达异常导致子宫内膜容受性下降可能是不明原因不孕症的病因之一。有研究证实，白细胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)和IL-1受体拮抗剂(interleukin-1 receptorantagonist,IL-1ra) 共同存在于子宫内膜,并通过其在子宫内膜周期性表达调控生殖[3]。目前关于IL-1β及IL-1ra在不明原因不孕患者子宫内膜种植窗口期的表达鲜有报道。本研究通过检测并对比不明原因不孕患者与正常女性子宫内膜种植窗期IL-1β及IL-1ra 信使核苷酸(messenger ribonucleic acid,mRNA)是否存在表达差异，为不明原因不孕症患者的临床干预提供新思路。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2014-05—2016-10间在南山区妇幼保健院就诊的不明原因不孕患者50例为观察组，年龄25～35岁，平均年龄(31.27±2.24)岁，月经周期26～32 d，平均月经周期(28.80±2.04)d。纳入标准：(1)知情同意；(2)排除内分泌、免疫性因素引起的不孕；(3)排除盆腔及生殖系统器质性及感染性病变导致的不孕；(4)半年内未用激素类药物；(5)不孕期限≥1年；(6)丈夫精液检查:密度≥2000 万/ mL,活动力a≥25%或a+ b≥50%,头部形态正常精子≥40%。对照组：选取同期在该院就诊曾有过生育史或男方不育后经ICSI、AID成功受孕的女性50例为对照组,年龄23～36岁，平均年龄(30.44±1.78)岁，月经周期26～33 d，平均月经周期(29.56±1.66)d,纳入标准:(1)知情同意；(2)排除内分泌、免疫性因素引起的不孕；(3)排除盆腔及生殖系统器质性及感染性病变导致的不孕；(4)半年内未用激素类药物。两组患者在年龄、月经周期等一般资料方面差异无统计学意义(P>0.05)。

1.2 标本收集及保存

取观察组及对照组部分子宫内膜， 按Noyes 的评分标准[4]判定为黄体中期子宫内膜，在生理盐水中反复漂洗干净，装入RNA酶灭活的冷冻管，液氮速冻后，置-70℃冻存。

1.3 方法

采用RT-PCR 方法检测子宫内膜组织中IL-1β、IL-1ra的mRNA表达。

(1)子宫内膜组织中RNA的提取。 取研究对象标本约50mg，使用RNAiso Plus(Takara，9109)提取内膜组织中total RNA。取其中2 μL用Nanodrop 2000测浓度，根据测得的浓度做逆转录。剩余total RNA溶液-80 ℃保存。(2)cDNA第一链的合成。 cDNA第一链的合成按照RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit(Thermo Fisher，K1622)的说明书进行。步骤如下：①在无菌、无RNA酶的PCR管中按照下列体系添加试剂：RNA模版4 μg，Random primer 1 μL，Oligo(dT)primer 1 μL，Water，nuclease-free to 12 μL，此步反应总体系为12 μL。 ②混匀，置于PCR仪中65℃，5min。③反应结束后取出PCR管置于冰上，再按5×Reaction Buffer4 μL，RibolockTM RNase Inhibitor 1 μL，10mM dNTP Mix 2 μL，Reverse Transcriptase 1 μL的反应体系添加试剂。 ④混匀，置于PCR仪中42 ℃反应60min； 70 ℃反应5min终止。所得产物保存于-20℃冰箱中备用。(3)目的基因片段扩增。①引物的设计与合成。 根据Genbank中人类IL-1β和IL-1RA的序列，利用primer premier 5.0软件辅助设计引物，并用NCBI中Primer-BLAST检测引物特异性。人IL-1β上游引物：5-AAACAGATGAAGTGCTCCTTCCAGG-3′，下游引物：5′-TGGAGAACACCACTTGTTGCTCCA-3′，引物总长391bp；人IL-1RA上游引物：5′-AATCCAGCAAGATGCAAGCC-3′，下游引物5′-ACGCCTTCGTCAGGCATATT-3′，引物总长406bp；人β-actin上游引物5′-CATGTACGTTGCTATCCAGGC-3′，下游引物5′-CTCCTTAATGTCACGCACGAT-3′，引物总长250bp。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。②PCR反应。 PCR反应体系：DNA模版0.5 μL，2x Taq MasterMix 12.5 μL，RNase free water 11 μL，上下游引物各1 μL，共25μL；PCR循环参数：94℃预变性3min，94℃ 变性30s，58.6℃ 退火20s *31个循环，72℃ 延伸1min， 72℃ 终延伸10min；产物进行琼脂糖凝胶电泳，电泳结果用凝胶成像系统(Tanon,1600)拍照分析。(4)结果分析。将β-actin作为定量IL-1β及IL-1ra 的参照物，利用凝胶成像分析系统测出IL-1β，IL-1ra和β-actin 的条带灰度，分别将IL-1β灰度值、IL-1ra灰度值与β-actin灰度值相除计算其相对系数，从而得出IL-1β和IL-1ra 基因产物的相对定量。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 观察组与对照组子宫内膜种植窗口期IL-1β mRNA表达情况

IL-1β mRNA扩增效果见图1，其中观察组阳性检出率为86%，对照组为92%，差异无统计学意义(P>0.05)，见表1；检出阳性标本中，观察组表达平均值为0.165±0.123，低于对照组表达平均值0.331±0.121，差异有统计学意义(P<0.05)，见表2。

注：M:标记物；1,2,3,4,5为观察组；1’,2’,3’,4’,5’为对照组.图1 子宫内膜种植窗口期IL-1β mRNA RT-PCR扩增图

2.2 观察组与对照组子宫内膜种植窗口期IL-1ra mRNA表达情况

IL-1ra mRNA扩增效果见图2，其中观察组阳性检出率为84%，对照组为82%，差异无统计学意义(P>0.05)，见表1；检出阳性标本中，观察组表达平均值为0.255±0.094，低于对照组表达平均值0.032±0.039，差异有统计学意义(P<0.05)，见表2。

注：M:标记物r；1,2,3,4,5为观察组；1’,2’,3’,4’,5’为对照组图2 子宫内膜种植窗口期IL-1ra mRNA RT-PCR扩增图

2.3 观察组与对照组子宫内膜种植窗口期IL-1ra与IL-1β表达比情况

IL-1β mRNA及IL-1ra mRNA均阳性者，观察组检出率阳性为84%，对照组为82%，差异无统计学意义(P>0.05)，见表1；观察组IL-1ra与IL-1β表达比(IL-1ra/IL-1β)平均值为9.365±9.623，明显高于对照组表达平均值0.233±0.178，差异有统计学意义(P<0.05)，见表2。

表1 观察组与对照组子宫内膜种植窗口期IL-1β mRNA、IL-1ra mRNA检出情况

表2 观察组与对照组子宫内膜种植窗口期IL-1β mRNA、

3 讨论

胚胎着床是一个极其复杂的程序化过程，良好的子宫内膜容受性和胚胎植入能力是决定着床成功与否的关键。子宫内膜容受性是指子宫内膜允许胚胎黏附、侵入并诱导内膜间质发生一系列变化，最终使胚胎顺利植入的一种状态。子宫内膜种植窗口期[5]是指子宫内膜表现出最大容受性的一段时期，大约在月经周期的第19～24 d,或在LH 峰出现后的7～11 d，一旦超过该期，子宫内膜的着床窗闭合，胚胎无法植入。随着围着床期各种调节因素的不断深入研究，发现种植窗口期的出现和消失依赖于子宫内膜中一套特定基因的时空特异性表达并与某些黏附分子、细胞因子的调节相关。生殖系统的细胞因子主要由围着床期子宫内膜细胞分泌，通过自分泌、旁分泌方式执行多种生理功能，其表达峰谷值与植入窗口期相吻合，且定位较专一，在子宫内膜容受性形成上发挥重要作用。子宫内膜局部细胞因子表达失衡导致子宫内膜容受性下降可能是导致不明原因不孕症的病因之一。

IL-1 由3个相关多肽组成,其中IL-1α及IL-1β为受体激动因子, IL-1rα为受体拮抗因子。三者都主要与受体IL-1I( IL-1Rt I)结合发挥作用。IL-1通过诱导上皮细胞黏附分子表达的增加,使上皮对胚泡的黏附性升高,调节子宫内膜容受性[6]；通过激发子宫内膜上皮细胞整合素avβ3的表达,并通过控制其效应分子瘦素( leptin)及其受体的表达量间断控制整合素avβ3的表达量，使子宫内膜暴露着床窗，诱导胚泡着床，IL-1 ra 则作用相反，妨碍胚泡与子宫内膜的黏附[7]。研究表明, IL-1β在分泌中期形成表达高峰，IL-1ra 在分泌中期形成表达低谷，通过两者的比值调控IL-1 在生殖活动中的作用[8-9]。

关于IL-1β及IL-1ra在不明原因不孕女性子宫内膜种植窗口期的表达有无异常，目前鲜有报道。本研究中,在参与试验的病例子宫内膜种植窗期几乎均存在IL-1β及IL-1ra mRNA表达，提示二者可能在参与子宫内膜容受性建立的方面发挥重要作用；与正常女性相比,不明原因不孕妇女子宫内膜种植窗口期IL-1β表达下降，而IL-1ra mRNA表达则明显上升，提示二者表达异常可能是导致不明原因不孕症的主要分子机制之一；研究显示[9]，成功的着床依赖于IL-1B/ IL-1 ra 在着床部位有适当比例，而本试验中，不明原因不孕患者IL-1ra与IL-1β表达比平均值为(9.365±9.623)，明显高于对照组表达比平均值(0.233±0.178)，提示IL-1β及IL-1ra mRNA表达比例失调可能是妨碍上皮对胚泡的黏附的重要原因之一，这对于临床上通过检测IL-1β及IL-1ra的表达来诊断以及治疗不明原因不孕提供了新思路。

[1] 王映桥,郭颐顿译.性学总览[M].天津:天津人民出版社,1992:678.

[2] SIMON C,MARTIN J C,PELLICER A.Paracrine regulators of implantation [J].Bail lieres Best Pract Res Clin Obstet Gynaecol,2000,14(5):815-826.

[3] HUANG H Y,WEN Y,KRUESSEL J S,etal.Interleukin( IL)-1beta regulation of IL-1beta and IL-1 receptor antagonist expression in cultured human endometrial stromal cells [J].J Clin Endocrinol Metab,2001,86(3) :1387-1393.

[4] NOYES R W,HERTIG A T,ROCK J.Dating the endometrial biopsy[J].Fertil Steril,1950,1(1) :3-7.

[5] LIM H J，DEY S.HB-EGF:a unique mediator of embryo-uterine interactions during implantation[J]． Exp Cell Res，2009，315(4):619-626．

[6] ROSSI M,SHARKEY A M,VIGANO P,etal.Identification of genes regulated by interleukin-1beta in human endometrial stromal cells [J].Reproduction,2005,130(5):721-729.

[7] SUNDER S,LENTON E A.Endocrinology of the peri-implantation period[J].Baillieres Best Pract Res Clin Obstet Gynecol,2000,14(5):789-800.

[8] BOUCHER A,KHARFI A,Akoum A-l,etal.Cycle-dependent expression of interleukin-1 receptor type II in the human endometrium[J].Bio l Reprod,2001,65( 3) :890-898.

[9] SIMON C,FRANCES A,PIQUETTE G N.The immune mediator interleukin-1 receptor antagonist prevents embryonic implantation[J].Endocrinology,1994,134:521.