脑缺血再灌注后Src激酶抑制剂PP2对神经元保护机制的探讨

刘桂锋，韩 亮，赵景伟

(1.吉林大学中日联谊医院 放射科， 吉林 长春130033； 2.吉林大学中日联谊医院 病理科， 吉林 长春130033； 3.吉林大学中日联谊医院 神经外科， 吉林 长春130033)

脑缺血再灌注后Src激酶抑制剂PP2对神经元保护机制的探讨

刘桂锋1，韩 亮2，赵景伟3*

(1.吉林大学中日联谊医院 放射科， 吉林 长春130033； 2.吉林大学中日联谊医院 病理科， 吉林 长春130033； 3.吉林大学中日联谊医院 神经外科， 吉林 长春130033)

目的 探讨Src激酶抑制剂PP2在大鼠脑缺血再灌注后对神经元延迟性死亡保护作用的机制。方法 建立Wistar大鼠全脑缺血再灌注动物模型，分为无缺血再灌注正常空白对照组(sham)，Src激酶抑制剂PP2实验组(PP2)和Src激酶抑制剂PP2类似物的实验对照组(PP3)。实验组及实验对照组Wistar大鼠在双侧颈动脉夹闭造成全脑缺血前30分钟于脑室内分别注射PP2和PP3，控制大鼠脑组织缺血时间均为10 min，再灌注时间均为72 h。于再灌注时取出大鼠脑组织，部分脑组织通过甲醛固定后行HE染色观察每组大鼠海马CA1区神经元存活数量；另外部分脑组织在-20℃环境下将丘脑背外侧皮层脑组织分离，并应用差速离心法分离出神经元，通过Western Blot分析神经元组分中Src激酶、NMDA受体及PSD蛋白的磷酸化变化情况。结果 通过HE病理切片发现，在成功建立了大鼠全脑缺血再灌注动物模型中海马CA1区神经元出现延迟性死亡的现象，大鼠海马CA1区神经元死亡数量PP2实验组的明显少于PP3实验对照组。Western Blot分析结果显示：与空白对照组比较，实验组及实验对照组神经元出现缺血延迟性死亡时NMDAR2B、NMDAR2A、PSD93及Src激酶的磷酸化表达明显升高(P<0.001)；实验组与实验对照组比较，Src激酶抑制剂PP2可显著下调脑缺血再灌注后NMDAR2B、NMDAR2A、PSD93及Src激酶的磷酸化表达(P<0.01)。结论 脑缺血再灌注后Src激酶抑制剂PP2可以对神经元起到保护作用，其机制可能与NMDAR2B、NMDAR2A、PSD93及Src磷酸化表达水平的改变有关。

神经元；缺血再灌注；Src激酶抑制剂PP2

(ChinJLabDiagn,2017,21:1072)

脑血管疾病是造成人类死亡的重要疾病之一，而其中80%-85%的脑血管疾病属于缺血性脑血管病[1]。缺血性脑卒中引起的患者神经功能障碍常常难以恢复，其原因与缺血区域脑组织即使在恢复血液再灌注后仍会发生神经元延迟性死亡的现象有关。目前，脑组织缺血再灌注后神经元延迟性死亡的分子机制仍不十分明确[2]，其主要原因可能与脑缺血再灌注时神经元中兴奋性氨基酸毒性作用、细胞内钙超载或自由基过度形成等有关[3,4]。本研究旨在观察和探讨Src激酶抑制剂PP2对脑缺血再灌注后神经元延迟性死亡保护作用及其分子机制。

1 材料与方法

1.1 主要仪器及试剂 成年雄性Wistar大鼠、呼吸机、麻醉机、显微手术器械均来自美国Charles River实验室，大鼠脑立体定向固定仪来自美国Stoelting公司，电泳仪、超声仪、蛋白浓度测定试剂盒来自美国Bio-rad公司，伊红染料、4%多聚甲醛来自美国Sigma公司，Src激酶抑制剂PP2、PP2类似物PP3、P-NMDAR2B(Tyr1472)、P-NMDAR2B(Tyr1325)、P-NMDAR2A(Tyr1246)、P-PSD93(Tyr340)和P-Src(Tyr416)抗体均来自美国Calbiochem公司。

1.2 大鼠侧脑室注药手术方法 术前动物禁食12 h，以5%异氟烷诱导麻醉气管插管，以2%异氟烷维持麻醉。将大鼠头部固定于立体定位仪上，于前囟右侧1.4 mm、前囟后0.9 mm位置单孔钻颅，以微量注射泵将15 μl PP2或PP3缓慢注入侧脑室，拔出针头，关颅。待大鼠完全清醒后拔出气管插管，30 min后行全脑缺血手术。实验分组：无缺血再灌注正常组(sham)，Src激酶抑制剂PP2实验组(PP2)和Src激酶抑制剂PP2类似物实验对照组(PP3)。

1.3 制作大鼠脑缺血模型手术方法 注药后的大鼠再次麻醉，分离出双侧颈总动脉，于右下肢股动脉插管回抽血液，使大鼠血压降至50 mmHg，以动脉瘤夹夹闭双侧颈总动脉，造成大鼠出现全脑缺血状态，维持缺血时间为10 min，并控制缺血过程中血压持续在45 mmHg左右。缺血结束后，血液回输。

1.4 大鼠脑组织HE染色 取出脑组织，放于含有4%多聚甲醛的PBS液中，在4℃温度下固定12 h，常规组织脱水、渗透、包埋，切片机按10 μm层厚行冠状位切片，挑选背侧丘脑处的脑片伊红染色。

1.5 差速离心法 -20℃环境下分离出丘脑背外侧皮层脑组织，按照重量体积比1：10加入匀浆缓冲液，匀浆器抽压35次，脑组织匀浆液在4℃条件下10 000 g离心10 min，去除上清，向沉淀部分中加入10倍体积的匀浆缓冲液，超声击打三次，每次5 s，然后在4℃ 条件下18 000 g离心20 min，沉淀部分即神经元组分。

1.6 Western blot检测 使用RIPA裂解液进行神经元组分总蛋白提取，并用BCA法测定蛋白浓度。加入蛋白上样缓冲液沸水浴5 min。12%SDS-PAGE电泳后200 mA电转至PVDF膜上，4℃下封闭过夜，室温TBST洗涤3次，一抗2 h，继续TBST洗涤3次，进行辣根过氧化物酶标记的二抗孵育2 h后漂洗，二氨基联苯胺显色。

1.7 统计学分析 数据统计分析采用SPSS 18.0软件和Graphpad Prism 5.0软件，组间比较采用t检验，以P<0.05为有差异统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠脑缺血动物模型的建立 病理切片HE染色观察缺血再灌注后海马CA1区神经元存活情况，脑组织未缺血及缺血3 min再灌注72 h后未出现神经元延迟性死亡的现象，全脑缺血10 min再灌注后大鼠脑组织海马CA1区神经元出现死亡现象。结果表明大鼠脑缺血动物模型建立成功，见图1。

A:未缺血组；B:缺血3 min组；C：缺血10 min组。箭头显示神经元死亡区域图1 大鼠脑缺血动物模型海马CA1区神经元死亡现象

2.2 Src激酶抑制剂PP2对脑缺血再灌注后神经元死亡干预结果 通过病理切片发现：大鼠脑组织海马CA1区神经元死亡数量，Src激酶抑制剂PP2实验组(PP2)的明显少于Src激酶抑制剂PP2类似物的实验对照组(PP3)，见图2。

图2 Src激酶抑制剂PP2对脑缺血再灌注后神经元死亡干预结果

2.3 脑缺血再灌注后Src激酶抑制剂PP2对神经元NMDAR2B、NMDAR2A、PSD93及Src激酶磷酸化表达水平的影响 Western Blot分析结果显示：与空白对照组比较，实验组及实验对照组神经元出现缺血延迟性死亡时NMDAR2B、NMDAR2A、PSD93及Src激酶的磷酸化表达明显升高(P<0.001)；实验组与实验对照组比较，Src激酶抑制剂PP2可显著下调脑缺血再灌注后NMDAR2B、NMDAR2A、PSD93及Src激酶的磷酸化表达(P<0.01)，见图3。

*P<0.001；#P<0.01图3 脑缺血再灌注后Src激酶抑制剂PP2对神经元NMDAR2B、NMDAR2A、PSD93及Src激酶磷酸化表达水平的影响

3 讨论

虽然脑缺血的研究是神经内科和神经外科研究的一个重要方向，但目前脑缺血后出现缺血灶周边的神经元延迟性死亡的分子机制仍未明确。前人研究认为：由NMDA受体介导的兴奋性神经毒性作用被认为是脑缺血常伴发缺血灶周边的神经元延迟性死亡的一个重要原因[3,4]。中枢神经系统中正常存在NMDA(N-methyl-D-aspartic acid，N-甲基-D-天冬氨酸)的广泛表达，而NMDA受体过度或持续激活可导致细胞内Ca2+超载，继而产生兴奋性神经毒作用。这种NMDA神经毒作用是引发缺血性脑损伤、中风、癫痫等病理状态下神经元死亡的关键[5]。因此，正常表达的NMDA受体参与神经元正常生理功能，异常表达的NMDA受体可引起神经元病理死亡[6，7]。Src是一种酪氨酸蛋白激酶，其正常作用是感知受体激活并向胞内传递信号的核心蛋白激酶。Src广泛参与脑组织中神经元的突触可行性及神经元的增殖、分裂和存活等生理活动[8]。由Src介导的受体磷酸化还可调节突触后膜NMDA受体群的动态平衡[9]。选择性阻断Src激酶的磷酸化信号，可减少大鼠脑缺血再灌注后由NMDA受体超激活介导的神经元延迟性死亡。所以Src家族酪氨酸蛋白激酶的抑制剂可能是一个潜在的治疗脑缺血的新药，有待进一步研究。

本实验中，我们应用大鼠双侧颈总动脉夹闭合并股动脉抽血降血压的方法建立了Wistar大鼠全脑缺血的动物模型。由于理论表明NMDA受体在兴奋性神经毒过程中的作用由Src蛋白激酶介导，因此在本实验中我们通过脑缺血前30 min脑室内注射选择性Src激酶的抑制剂PP2，同时通过观察建立的脑缺血前30 min脑室内注射PP2类似物PP3的实验对照组，分析PP2是否具有神经保护作用、并通过病理组织切片及蛋白印迹分析大鼠丘脑背外侧皮层脑组织内NMDA受体蛋白、Src酪氨酸蛋白激酶及相关蛋白的表达，来探讨PP2的作用机制。针对建立的Wistar大鼠全脑缺血动物模型，我们通过大鼠脑组织标本的病理检查实验发现：Src激酶抑制剂PP2实验组(PP2)的大鼠脑组织海马CA1区神经元死亡数量，明显少于Src激酶抑制剂PP2类似物的实验对照组(PP3)；通过大鼠脑组织标本的Western Blot分析发现：Src激酶抑制剂PP2可显著下调脑缺血再灌注后NMDAR2B、NMDAR2A、PSD93及Src激酶的磷酸化表达水平。本实验结果表明：PP2与减少脑缺血后神经元的延迟性死亡有关，PP2可能具有神经保护作用。我们的实验结果与Hou XY等的文献报道[10]相符。

本实验结果提示：脑缺血再灌注后Src激酶抑制剂PP2可以对神经元起到保护作用，其机制可能与NMDAR2B、NMDAR2A、PSD93及Src磷酸化表达水平的改变有关。

[1]张 妮,邵延坤.缺血性脑血管病急性期血压干预与预后[J].中国实验诊断学,2016,20(2):331.

[2]李培培,彭俊阳,姚建华.颈动脉狭窄与脑梗死发生的相关性分析及干预措施[J].中国实验诊断学,2016,20(4):691.

[3]Bai J,Lyden PD.Revisiting cerebral postischemicreperfusioninjury:new insights in understanding reperfusion failure,hemorrhage,and edema [J].Int J Stroke,2015,10(2):143.

[4]Kaur A,Kaur T,Singh B,et al.Curcumin alleviates ischemia reperfusion-induced acute kidney injury through NMDA receptor antagonism in rats [J].Ren Fail,2016,38(9):1462.

[5]Petralia RS,Wang YX,Hua F,et al.Organization of NMDA receptors at extrasynaptic locations[J].Neuroscience,2010,167(1):68.

[6]Hardingham GE,Bading H.Synaptic versus extrasynaptic NMDA receptor signaling:implications for neurodegenerative disorders[J].Nat Rev Neurosci,2010,11(10):682.

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[9]Jiang X,Mu D,Biran V,et al.Activated Src kinases interact with the N-methyl- D-aspartate receptor after neonatal brain ischemia[J].Ann Neurol,2008,63(5):632.

[10]Hou XY,Liu Y,Zhang GY.PP2,a potent inhibitor of Src family kinases,protects against hippocampal CA1 pyramidal cell death after transient global brain ischemia [J].Neurosci Lett,2007,420(3):235.

The protection mechanism of Src kinase inhibitor PP2 on neurons after cerebral ischemia reperfusion

LIUGui-feng,HANLiang,ZHAOJing-wei.

(China-JapanUnionHospitalofJilinUniversity,Changchun130033,China)

Objective To investigate the protection mechanism of Src kinase inhibitor PP2 on delayed neuron death after cerebral ischemia reperfusion.Methods Wistar rats with global cerebral ischemia-reperfusion model divided into is the normal group (sham),Src kinase inhibitor PP2 group (PP2) and Src kinase inhibitor PP2 analogue control group (PP3) are used.30 minutes before the whole cerebral ischemia of rats the drug is injected,ischemia time for 10 min,reperfusion time of 72 h.Brain tissue of rat is fixed by formalin and stained by HE on arriving reperfusion.The number of survival neuron in hippocampal CA1 between the test group and contral groups is observed.Brain tissues from another part of the rats are rapidly frozen in liquid nitrogen under anesthesia.Brain tissues from hypothalamic dorsolateral cortex are separated in the -20℃,the various subcellular fractions are separated by differential centrifugation,the phosphorylation status of Src kinase,NMDA receptors and PSD protein in the neurons component are analyzed by Western Blot.Results The successfully established the whole cerebral ischemia reperfusion animal models of rats hippocampus CA1 area neurons in delayed the phenomenon of death.The number of neuronal death with cerebral ischemia and reperfusion for 72 h from PP2 treatment group with intraventricular 15 μg PP2 given 30 min before ischemia was significantly less than that of the control group according to HE pathological findings in the hippocampal CA1.Western Blot analysis results indicate that the phosphorylation of NMDAR2B,NMDAR2A,PSD93 and Src expression increased significantly indelayed neuron death after cerebral ischemia reperfusion (P<0.001),while the Src kinase inhibitor PP2 can significantly decreasethe expression of NMDAR2B,NMDAR2A,PSD93 and Src phosphorylation after cerebral ischemia reperfusion (P<0.01).Conclusion Src kinase inhibitor PP2 can protect neurons and its mechanism may be related to NMDAR2B,NMDAR2A,PSD93 and Src phosphorylation expression level change after cerebral ischemia reperfusion.

Neurons;Ischemia reperfusion;Src kinase inhibitor PP2

吉林省科学技术厅青年科研基金项目(20140520015JH)

*通讯作者

1007-4287(2017)06-1072-04

R743

A

2016-10-14)