基于指纹图谱和化学计量学的多基原秦艽药材化学品质比较研究

张晓灿，李杨，罗丹丹，陶爱恩，段宝忠

（大理大学药学与化学学院，云南大理671000）

基于指纹图谱和化学计量学的多基原秦艽药材化学品质比较研究

张晓灿，李杨，罗丹丹，陶爱恩，段宝忠*

（大理大学药学与化学学院，云南大理671000）

目的：比较秦艽药材3种基原药材秦艽、小秦艽和粗茎秦艽的化学品质差异，为多基原秦艽药材品质评价提供参考。方法：采用高效液相色谱法，建立3种药材的HPLC指纹图谱，结合化学计量学方法对其品质进行比较。结果：3种药材的化学指纹图谱种间相似度有一定差异，与秦艽药材共有模式图谱相比，秦艽种内相似度均大于0.990；小秦艽与其种间相似度为0.864和0.823；粗茎秦艽在0.643～0.912之间。聚类分析和主成分分析将17批秦艽药材分成秦艽、小秦艽和粗茎秦艽3类。结论：秦艽、小秦艽、粗茎秦艽3种药材化学成分存在一定差异，但主要成分峰形特征相似；化学计量学方法可用于不同品种秦艽的基原识别。

多基原；秦艽；指纹图谱；化学计量学；品质差异

中药是多种化学成分组成的复杂的集合体，对于中药的质量控制一直是一个难点，多基原药材使得中药质量控制更加复杂化〔1〕。秦艽是重要的传统常用中药〔2〕，为典型的多基原药材，其法定来源有龙胆科植物秦艽Gentiana macrophylla Pall.、麻花秦艽G.straminea Maxim.、粗茎秦艽G.crassicaulis Duthie ex Burk.或小秦艽G.dahurica Fisch.4种基原的干燥根〔3〕。由于中药的药效取决于其所含的化学物质，多基原药材间的化学成分可能有差别或完全不同，从而导致药理作用和临床疗效也不尽一致〔4〕。近年来，众多学者对秦艽类药材的药材品质和指纹图谱进行了大量的研究〔5-8〕，但未见对药典秦艽药材不同基原的指纹图谱进行比较的相关研究。鉴于此，本研究采用高效液相色谱法，建立了秦艽药典3种基原药材秦艽、粗茎秦艽和小秦艽HPLC指纹图谱，利用中药色谱指纹图谱和化学计量学方法，分析比较了秦艽3种基原药材的质量差异，以期为多基原秦艽药材的质量标准制定提供科学参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂Agilent 1200高效液相色谱仪（Agilent Technologies，USA），包括：G1322A在线脱气机、G1311A四元梯度泵、G1329A进样器、G1316A柱温箱、G1314B VWD检测器和ChemStation色谱工作站。AgilentZorbax SB C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5μm），超声波清洗仪（昆山市超声仪器有限公司，KQ-5200DB），AL204电子天平（梅特勒-托利多仪器上海有限公司）。色谱级甲醇（Fisher Scientific，Fairlawn New Jersey），水为超纯水，其他试剂均为分析纯。

17批秦艽、小秦艽和粗茎秦艽药材收集于2012年4月至2016年1月，药材经段宝忠副教授鉴定，标本存放于大理大学中药标本馆。见表1。

表1 样品信息表

1.2 色谱条件、供试品溶液制备按参考文献〔8〕进行。

1.3 数据分析指纹图谱数据使用中药指纹图谱相似度评价系统（2.0版）软件计算各批样品的相似度；使用SPSS 17.0软件对矩阵数据进行标准化处理后进行聚类分析；使用The Unscrambler X 10.4分析软件，进行主成分分析（PCA）。

2 结果

2.1 方法学考察精密度试验：取同一供试品溶液，按“1.2”项下色谱条件连续进样6次，记录各色谱峰峰面积，RSD＜0.86%，保留时间RSD＜0.32%，表明仪器精密度良好。重复性试验：取同一样品6份，按“1.2”项下方法制备，进样测定。各色谱峰峰面积RSD＜0.97%，表明方法重复性良好。稳定性试验：取同一份供试品溶液，分别在0、4、8、12、18、24、48 h进行测定，各色谱峰峰面积RSD＜1.27%，表明各供试品溶液在48 h内稳定。

2.2 指纹图谱相似度采用中药指纹图谱相似度评价系统（2.0版），生成10批秦艽药材共有模式色谱图，见图1。将17批药材导入软件与秦艽共有模式色谱图比较，计算相似度。结果显示，10批秦艽药材与秦艽共有模式图谱比较，相似度均大于0.990；两批小秦艽药材与秦艽共有模式图谱比较，相似度为0.864和0.823；5批粗茎秦艽药材与共有模式图谱比较，相似度在0.643～0.912之间，见表2。

图1 10批秦艽药材的HPLC指纹色谱图谱

表2 与秦艽共有模式图谱比较相似度结果

2.3 样品聚类分析（HCA）将17批样品共有色谱峰的峰面积与药材称样量相比，对单位质量药材峰面积进行量化，得17×10阶的数据矩阵，使用Ward’s方法和欧氏距离进行聚类分析，聚类结果见图2。从图2可看出，3种秦艽药材分别被单独分为3类，见图2中Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ，其中Ⅰ类包括10批秦艽样品，S10和S11号样品经过多次聚类后与其他8批秦艽样品聚为一类；Ⅱ类包括5批粗茎秦艽样品；Ⅲ类包括两批小秦艽样品。

图2 样品聚类分析图

2.4 样品主成分分析（PCA）对单位质量3种秦艽药材峰面积进行量化处理后，使用The Unscrambler X 10.4分析软件，对17批样品共有指纹图谱信息进行主成分分析。以第一主成分（PC1）和第二主成分（PC2）的得分为横纵坐标，绘制得分散点图，见图3。结果显示3种秦艽药材得到了很好的归类，17批样本间内在的相互关系可进一步较好地体现出来，样品被分为3类，即秦艽类（Ⅰ类）、粗茎秦艽类（Ⅱ类）和小秦艽类（Ⅲ类）。主成分分析结果与聚类分析结果一致，结合图3可以实现3种秦艽药材的鉴别。

图3 17批样品主成分分析图

3 讨论

本研究采用HPLC指纹图谱和化学计量学方法研究了秦艽的3种基原植物药材的化学指纹特征差异。17批样品与秦艽共有模式图谱比较，10批秦艽样品相似度均大于0.990，秦艽药材种内质量均一，稳定性较好；两批小秦艽药材与秦艽比较相似度小于0.865，表明秦艽与小秦艽药材化学指纹差异较大，吴靳荣等研究发现小秦艽中各组分的含量明显低于其他种正品秦艽〔9〕，结合本研究中的相似度计算结果，表明秦艽与小秦艽化学指纹差异较大；5批粗茎秦艽样品中，与秦艽相比，S3和S7号样品的相似度分别为0.765，0.643，其余3批样品相似度在0.900～0.912之间，表明粗茎秦艽与秦艽相比指纹图谱有一定差异。聚类分析（HCA）和主成分分析（PCA）结果将17批样品分为了秦艽、粗茎秦艽和小秦艽3类。罗焜等对秦艽几种基原植物的ITS2序列的研究表明，几种药材的碱基存在明显差异〔10〕。本研究结果表明秦艽、小秦艽、粗茎秦艽3种药材的化学指纹存在差异。

中药材品种的多基原性由来已久，唐·《新修本草》注“蓝实有三种”；《本草拾遗》云“三棱总有三四种”；《图经本草》《证类本草》中一物数图者甚多，柴胡有五图、黄精有十图；《中华人民共和国药典》2015年版收载的中药材及饮片，多基原药材品种有153种之多。多基原中药品种的质量差异直接关系到临床用药的有效性和安全性〔11〕。上述秦艽的3种基原植物成分差异明显，必然影响其临床疗效，但目前3种秦艽药材在临床使用中剂量和用途相同，目前有关其药效的差异尚不明确，其科学性有待进一步的实验证实。采用现代学科新技术对中药多基原药材进行系统的研究，构建符合多基原药材特点的质量评价模式，对保证中药产品的安全有效、质量可控，使国际社会理解和接受中医药具有十分重要的意义。

〔1〕杨丰庆，李绍平.基于莪术研究探讨多基原中药指纹图谱的建立〔C〕∕∕武汉：中国药学杂志岛津杯第八届全国药物分析优秀论文评选交流会论文集.2007：117-123.

〔2〕王琳，聂艳琼，孙娜，等.秦艽的化学成分、分子生药学和药理学研究进展〔J〕.安徽农业科学，2012，（18）：9629-9630.

〔3〕国家药典委员会.中华人民共和国药典〔M〕.北京：中国医药科技出版社，2015.

〔4〕王陈.基于二维液相色谱技术的元胡活性成分筛选及其药效和毒性机制的蛋白组学研究〔D〕.上海：第二军医大学，2010.

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〔6〕李晓蒙，何新荣.秦艽药材HPLC指纹图谱研究〔J〕.中成药，2004，26（1）：4-7.

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〔10〕罗焜，马培，姚辉，等.多基原药材秦艽ITS2条形码鉴定研究〔J〕.药学学报，2012，47（12）：1710-1717.

〔11〕JIANG Y，DAVID B，TU P，et al.Recent analytical approaches in quality control of traditional Chinese medicines：a review〔J〕.AnalChim Acta，2010，657（1）：9-18.

Species Differentiation and Quality Assessmentof Gentiana by High-performance Liquid Chromatographic Fingerprintand Chemometrics Analysis

Zhang Xiaocan,Li Yang,Luo Dandan,Tao Aien,Duan Baozhong*
（College ofPharmacy and Chemistry,Dali University,Dali,Yunnan 671000,China）

Objective:To compare the chemical quality among three species of Gentiana.Methods:HPLC fingerprints of the three kinds of Gentiana have been established and analyzed with chemometric methods including similarity evaluation,hierarchical cluster analysis and principalcomponentanalysis.Results:There is significant difference among the three species of Gentiana expressed by the fingerprint patterns.The result of chemometric analysis indicated that 17 samples were classified into three categories.Conclusion:HPLC fingerprintcombined with chemometrics analysis is an effective method for the discrimination ofdifferentgroups of herbalmedicines.

Multiple sources;Gentianae macrophyllae Radix;HPLC fingerprint;chemometric methods;quality difference

R282

A

2096-2266（2017）06-0037-04

10.3969∕j.issn.2096-2266.2017.06.009

（责任编辑李杨）

云南省教育厅科学研究基金资助项目（2014Z135）；云南省应用基础研究计划项目（2016FD073）；云南省中青年学术技术带头人后备人才资助项目（2015HB058）；云南省科技计划资助项目（2012CG019；2014RE016）

2017-01-10

2017-03-21

张晓灿，硕士研究生，主要从事中药资源与鉴定研究.

*通信作者：段宝忠，副教授.